Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Медицинские науки
Онкология

Диссертационная работа:

Прилуцкая Марина Осиповна. Опухолевая контаминация аутотрансплантатов гемопоэтических тканей у больных раком молочной железы: прогностические факторы и клиническое значение : прогностические факторы и клиническое значение : Дис. ... канд. биол. наук : 14.00.14 Москва, 2005 103 с. РГБ ОД, 61:05-3/1100

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Опухолевая контаминация

гемопоэтических продуктов — важная проблема аутотраисплантации и высокодозной химиотерапии у онкологических больных

1.1. Высокодозная химиотерапия 12

1.2 Аутотрансплантация стволовых клеток крови 15

  1. Мобилизация стволовых гемопоэтических клеток 16

  2. Особенности протоколов мобилизации СГК при ВХТ 19

  3. Определение СГК с помощью экспрессии CD34 20

  4. Резидуальные опухолевые клетки в костном мозге

и периферической крови 22

  1. Методы выявления резидуальных опухолевых клеток 23

  2. Методы молекулярной биологии для выявления

рсзидуальных опухолевых клеток 24

  1. Иммунодиагностика опухолей человека 26

  2. Характеристики МКАТ, предназначенных для очистки трансплантата 30

  3. Очистка с помощью опосредованного комплементом лизиса 31

  4. Очистка с помощью иммунотоксинов 33

  5. Очистка с применением иммуномагнитных микросфер 34

  6. Положительный отбор гемопоэтических клеток как

альтернативный метод очистки 37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

  1. Отбор пациенток для исследования 39

  2. Сбор ПСК 39

  3. Получение образцов КМ и ПСК от больных РМЖ 40

  4. Получение образцов ПСК от доноров без онкопатологии 41

  5. Проведение курсов ВХТ 41

  6. Оценка реакции на проводимую терапию 42

  7. Получение фракции мононуклеаров 42

  8. Стандартный иммуноцитохимический анализ (ИЦА) 43

  9. Селекция клеток, экспрессирующих CD34 45

  10. Иммуноцитохимический анализ с иммунным

обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ) 45

2.10.1. Построение стандартных кривых анализа 48

2.11. Исследование клоногенного роста резидуальных

опухолевых клеток in vitro 48

2 Л 1.1. Идентификация колоний опухолевых клеток 49

2.12. Статистический анализ 49

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3,1. Исследование факторов, влияющих їй контаминацию продуктов

гемопоэтических стволовых клеток у больных метастатическим 51

раком молочной железы.

Частота контаминации образцов ПСК и костного мозга 52

Исследование ассоциации между контаминацией костного
мозга и контаминацией образцов ПСК 52

Исследование влияния схемы мобилизационной терапии
на контаминацию образцов ПСК 52

Исследование влияния количества процедур лейкафереза
на частоту контаминации образцов ПСК 55

3.1.5 Исследование контаминации образцов ПСК в зависимости от

типа мобилизации у больных РМЖ с частичной и полной ремиссией 57

3.2. Опухолевая контаминация ПСК как фактор прогноза выживаемости без
прогрессирования болезни и полной выживаемости больных РМЖ 58

3.2.1. Мультивариантный анализ взаимозависимости факторов прогноза 60

  1. Исследование клоно ген ного роста опухолевых клеток-контаминант 62

  2. Характеристика нового метода детекции опухолевых клеток в образцах ПСК: имму но цитохимического анализа с этапом иммунного обогащения на магнитных микросферах 64

3.4.1. Отработка и характеристика метода ИЦА с обогащением на

магнитных микросферах (ИЦА-ОММ) 64

3.5. Исследование эффективности очистки продуктов ПСК от
остаточных клеток рака молочной железы в результате

позитивной селекции клеток на экспрессию CD34 61

3.5.1. Определение контаминации продуктов лейкафереза клетками

РМЖ с помощью стандартного ИЦА 70

3.5.2. Определение контаминации продуктов лейкафереза клетками

РМЖ с помощью ИЦА-ОММ 71

3.5.3. Количество опухолевых клеток в продуктах лейкафереза до
селекции на CD34 как фактор прогноза контаминации
СВ34-позитивных фракций 73

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 75

ВЫВОДЫ 86

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение к работе:

Несмотря на некоторые позитивные сдвиги в ранней диагностике рака молочной железы (РМЖ) благодаря все более широкому применению маммографии, абсолютное число больных с запущенными формами заболевания (стадия HIb-IV) увеличивается как в России и странах СНГ, так и в большинстве государств Западной и Центральной Европы. В США удельный вес таких пациенток заметно снизился в связи с проведением широкомасштабного скрининга этого заболевания. Однако, и в этой стране абсолютное число больных РМЖ с поздними стадиями остается большим из-за высокой и неуклонно нарастающей заболеваемости, которая в 2.5 раза превышает российские показатели [Моисеенко с соавт., (стр.5)]. Хотя комбинированная химиотерапия пациенток на поздних стадиях РМЖ часто позволяет отсрочить прогрессию заболевания, в конечном итоге у них развиваются рецидивы, приводящие к летальному исходу. В связи с этим, весьма актуальна разработка новых, более эффективных методов лечения больных РМЖ на поздних стадиях заболевания. Одной из разработок в данном направлении является лечение высокими дозами химиопрспаратов (высокодозная химиотерапия, ВХТ). Применение ВХТ для лечения больных РМЖ не дало столь яркого эффекта, как при лечении гемобластозов и некоторых быстрорастущих солидных опухолей человека, в частности, нейробластомы [Моисеенко с соавт. (стр. 98), Stadmauer с соавт., Peters с соавт., Cramp с соавт., Hartmann с соавт., Stram с соавт.]. Однако, в целом ряде работ отмечается действенность ВХТ при лечении больных РМЖ с ограниченным метастатическим поражением и хорошим ответом на индукционную химиотерапию [Shpall с соавт., Rowlings РА с соавт., Berry DA с соавт,]. Кроме того, этот вид лечения иногда проводится даже с адъюваптной целью у больных РМЖ, имеющих высокий риск возникновения рецидива [Моисеенко с соавт. (стр. 128)].

Угнетение гемопоэза, обусловленное применением высоких доз цитостатиков, можно компенсировать инфузией аллогенных либо аутологичных клеток костного мозга (КМ) или стволовых клеток из периферической крови (периферических стволовых клеток, ПСК). Трансплантация аутологичных гемопоэтических клеток имеет несколько потенциальных преимуществ по сравнению с аллогеннои трансплантацией: нет необходимости в наличии гистосовместимого донора, отсутствует риск развития реакции «трансплантат против хозяина». Таким образом, использование аутотрансплантатов более безопасно. Главным препятствием к применению аутотрансплантатов с целью восстановления гемопоэза после ВХТ является их частая контаминация опухолевыми клетками. Реипфузия таких клеток потенциально способна привести к возникновению рецидива заболевания. Чтобы минимизировать этот эффект, костный мозг либо ПСК стараются забирать у пациентки на стадии полной ремиссии, когда доказательства контаминации костного мозга или стволовых клеток из периферической крови отсутствуют. Другим возможным решением этой проблемы является удаление из трансплантатов злокачественных клеток-контаминант без нарушения функции клеток-предшественниц гемопоэза, так называемая «очистка». Для того чтобы выявить опухолевые клетки в гемопоэтических продуктах, а также оценить эффективность очистки аутотрансплантатов, необходимо иметь в распоряжении достаточно чувствительные методы детекции таких опухолевых клеток-контаминант. В настоящее время существует несколько методов выявления остаточных опухолевых клеток, у каждого из которых есть свои преимущества и недостатки (более подробно это будет описано в литературном обзоре). Необходимо подчеркнуть, однако, что целесообразность применения того или иного метода обнаружения остаточных опухолевых клеток напрямую связана с клиническими, морфологическими и молекулярно-генетическими особенностями конкретного новообразования и требует проведения тщательных исследований.

7 Другой важной проблемой, связанной с проведением аутотрансплантации

гемопоэтических тканей онкоболышх, является выбор источника аутотрансплантата:

либо костный мозг, либо стволовые клетки из периферической крови (периферические

стволовые клетки, ГТСК). Если в начале 90-х годов прошлого века преимущество

отдавалось аутотрансплантации костного мозга (КМ), то к концу 90-х годов в

подавляющем большинстве случаев стали использовать только ПСК. Это обусловлено

целым рядом преимуществ, которые имеют ПСК как источник стволовых клеток по

сравнению с КМ. (Эти преимущества будут описаны в главе «Обзор литературы»).

Однако, концентрация ПСК в периферической крови чрезвычайно низка. Существенно

увеличить количество и качество ПСК в продуктах лейкафереза удалось благодаря

введению в практику мобилизационной терапии. В настоящее время используют две

принципиальные схемы мобилизации ПСК: или комбинацию миелосупрессивной

химиотерапии с воздействием факторов роста гемопоэтических клеток, или мобилизацию

только с помощью факторов роста. При этом ассоциация между применением той ипи

иной схемы мобилизации и контаминацией продуктов ПСК исследована недостаточно.

Таким образом, исследование характера контаминации продуктов КМ и ПСК на

разных этапах их подготовки к использованию в качестве аутотрансплантатов имеет

большое значение для оптимизации этой процедуры. Эта оптимизация связана с

необходимостью эффективного обнаружения опухолевых клеток и их последующего

удаления из состава трансплантата. Данная процедура направлена на снижение

возможного риска возникновения рецидива, обусловленного введением в организм

больного в составе трансплантата остаточных опухолевых клеток.

Цель работы: исследование факторов, влияющих на опухолевую контаминацию

аутотрансплантатов ПСК, а также клиническое значение этой контаминации при

проведении высокодозной химиотерапии у больных раком молочной железы.

8 Были поставлены следующие задачи:

  1. Провести сравнительный анализ частоты и интенсивности контаминации опухолевыми клетками костного мозга и продуктов лейкафереза у больных РМЖ с помощью стандартного иммуноцитохимического анализа,

  2. Выявить клинические и терапевтические факторы, способные влиять на контаминацию ПСК раковыми клетками.

3. Оценить жизнеспособность «остаточных» опухолевых клеток в составе образцов
костного мозга и ПСК с помощью теста на клоногенный рост клеток in vitro.

  1. Исследовать, ассоциируется ли фактор контаминации продуктов ПСК с выживаемостью больных РМЖ.

  2. Исследовать, повышается ли чувствительность традиционного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) благодаря проведению этапа предварительного иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах.

6. ПрОВеСТИ Сравнительное Исследование эффеКТИВНОСТИ ОЧИСТКИ CD34-n03HTHBHbIX

фракций с помощью традиционного ИЦА и ИЦА с обогащением на магнитных микросферах (ИЦА-ОММ) .

Научная новизна работы Оценка контаминации гемопоэтических трансплантатов опухолевыми клетками как фактора, потенциально влияющего на возникновение рецидивов и выживаемость больных РМЖ, ранее проводилась на выборках небольшого размера (в основном, менее 90 пациенток). Объединить данные этих исследований для совокупного анализа не представляется возможным из-за методологических различий [Weather с соавт., Cooper с соавт., Stadtmauer с соавт.]. Кроме того, далеко не все пациентки в процитированных работах адекватно реагировали па проведение ВХТ. В нашей работе эти недостатки были учтены. Впервые проведено крупномасштабное исследование (535 больных РМЖ) возможной корреляции между контаминацией КМ и ПСК опухолевыми клетками и

длительностью выживаемости больных на поздних стадиях РМЖ, адекватно

реагирующих на проведение В XT. Было установлено, что пациентки с контаминацией КМ характеризуются менее длительной выживаемостью без прогрессирования болезни, чем пациентки без нее. Контаминация ПСК является фактором, ассоциирующимся с снижением выживаемости только у пациенток, проходивших мобилизацию по комбинированной схеме и находящихся в состоянии частичной (но не полной) ремиссии на момент проведения лейкафереза. Были впервые подробно исследованы клинические и терапевтические факторы, влияющие на частоту контаминации в ПСК. Так, контаминация опухолевыми клетками КМ пациентки с высокой вероятностью позволяет предположить и контаминацию ими продуктов ПСК. Снижение частоты контаминации ПСК раковыми клетками наблюдалось при проведении комбинированной мобилизации и уменьшении количества лейкаферезов.

В данной работе был апробирован новый высокочувствительный метод обнаружения опухолевых клеток - иммуноцитохимический анализ с предварительным этапом иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах. Благодаря использованию этого метода удалось установить, что частота контаминации трансплантируемого материала гораздо выше, чем считалось ранее. Применение более чувствительного метода детекции остаточных опухолевых клеток для анализа фракций ПСК после селекции на С034-позитивные клетки позволило определить, что такая селекция является достаточно эффективным методом очистки продуктов лейкафереза от остаточных клеток РМЖ.

Научно-практическая значимость

В ходе работы показано, что опухолевая контаминация гемопоэтических тканей, предназначенных для аутотрансплалтации у больных РМЖ, является неблагоприятным прогностическим фактором. Кроме того, жизнеспособность опухолевых клеток-

контаминант была нами показана в исследовании их клоногенного роста in vitro. В целом,

полученные данные свидетельствуют о возможном участии содержащихся в трансплантате опухолевых клеток в возникновении рецидива заболевания. Таким образом, перед проведением трансплантации необходимо осуществить очистку гемопоэтических продуктов от злокачественных клеток-контаминаит. Нами также выявлен ряд клинических и терапевтических факторов, которые позволяют спрогнозировать вероятность контаминации ПСК у конкретной пациентки. Благодаря учету некоторых из этих факторов, например, при проведении мобилизации, можно снизить вероятность контаминации ПСК еще до процедуры «очистки». Так, у больных без метастазов в КМ проведение мобилизации по комбинированной схеме позволяет снизить частоту контаминации ПСК опухолевыми клетками. Кроме того, благодаря комбинированной мобилизации удается собрать необходимое количество ПСК с помощью меньшего количества процедур лейкафереза. Эти данные позволяют рекомендовать комбинированную схему мобилизации как оптимальную в сравнении с мобилизацией только цитокипами.

Был разработан и апробирован новый высокочувствительный метод детекции остаточных опухолевых клеток, представляющий собой сочетание традиционного иммуноцитохимического анализа (ИЦА) с этапом предварительного иммунного обогащения пула опухолевых клеток на магнитных микросферах. Чувствительность этого усовершенствованного метода в 20 - 50 раз выше традиционного ИЦА. Применение нового метода позволило установить, что уровень контаминации образцов гематопоэтической ткани у больных РМЖ гораздо выше, чем это считалось ранее: если стандартный ИЦА позволяет выявить контаминацию ПСК у 7% больных РМЖ на II - IV стадиях заболевания, то новый метод - у 86% пациенток. Повышение чувствительности метода детекции остаточных опухолевых клеток в трансплантате может иметь большое значение для оценки эффективности его очистки. Примерам могут служить полученные

нами данные по оценке уровня контаминации ПСК после проведения позитивной селекции на клетки, экспрессирующие CD34. Если стандартный ИЦА не позволил выявить опухолевые клетки ни в одном из 36 образцов CD34-no3HTHBHbrx фракций, то в ИЦА-ОММ опухолевые клетки обнаружены в 49% С034-позитивных фракций. Одновременно с этим у 8 пациенток (24%) при анализе с помощью ИЦА-ОММ опухолевые клетки были обнаружены только в С034-негативных фракциях, и не обнаруживались в СВ34-позитивных фракциях, то есть у этих пациенток благодаря позитивной селекции на CD34 удалось полностью очистить трансплантаты в пределах чувствительности ИЦА-ОМШ. Таким образом, благодаря более чувствительному методу детекции остаточных опухолевых клеток можно лучше оптимизировать процедуру очистки трансплантата. Другим возможным приложением высокочувствительного метода обнаружения опухолевых клеток может являться мониторинг за ходом лечения пациенток. Возникновение рецидива, по-видимому, должно сопровождаться повышением количества опухолевых клеток в периферической крови, и, вероятно, может быть зафиксировано с помощью этого метода. Возможность применения ИЦА-ОММ для мониторинга за возникновением рецидива РМЖ необходимо исследовать дополнительно,

Подобные работы
Перевощиков Александр Александрович
Клиническое значение экспрессии рецептора эпидермального фактора роста при раке молочной железы, яичников, толстой кишки и легкого
Полковников Евгений Сергеевич
Особенности спектрального ответа нормальных и патологически измененных тканей молочной железы при раке
Мельникова Ольга Анатольевна
Переносимость основных программ адъювантного и неоадъювантного лечения рака молочной железы как фактор, влияющий на интенсивность химиотерапевтического лечения [Электронный ресурс]
Ткачев Андрей Васильевич
Влияние социально-демографических и природных факторов на распространение рака молочной железы в условиях Дальнего Востока России
Шегай Петр Викторович
Диагностика и прогноз рака предстательной железы с использованием факторов роста и молекулярно-генетических маркеров
Зиннатуллина Гузель Фардинатовна
Определение факторов прогноза течения рака молочной железы на основании молекулярно-генетических исследований
Пьяных Павел Петрович
Динамика простатического специфического антигена как фактор прогноза у больных раком предстательной железы с биохимическим прогрессированием
Жернов Алексей Александрович
Факторы прогноза в лечении местно-распространенного и метастатического рака предстательной железы
Гурбанов Самир Сабеддинович
Факторы риска развития местно-регионарных рецидивов и отдаленных метатазов после органосохраняющих операций при раке молочной железы
Щербаков Александр Михайлович
Роль ангиогенного фактора VEGF, его рецепторов и антиапоптотических сигнальных белков Аkt и BCL-2 в развитии гормональной резистентности рака молочной железы

© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net