Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Медицинские науки
Гистология, цитология, эмбриология

Диссертационная работа:

Дьяков Илья Николаевич. Влияние микроокружения на функциональную активность в лимфоцитов : диссертация ... кандидата биологических наук : 14.00.36 / Дьяков Илья Николаевич; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН].- Москва, 2009.- 138 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/654

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

Содержание 2

Список сокращений 5

Введение 6

Актуальность проблемы 6

Цели и задачи 10

Научная новизна 12

Практическая значимость 13

Основные положения, выносимые на защиту 15

Часть 1. Обзор литературы 17

Глава 1. Субпопуляции В лимфоцитов 17

  1. Введение 17

  2. В-2 лимфоциты 21

  3. В-1 лимфоциты 27

  4. MZ-B лимфоциты 34

Глава 2. Роль микроокружения в функциональной активности В
лимфоцитов 39

  1. Введение 39

  2. В Клетки слизистых оболочек 40

  3. Сравнительная характеристика В-1 лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости у мыши 43

  1. Фенотипические различия В-1а клеток брюшной полости и селезенки 45

  2. Функциональные различия В-1а клеток брюшной полости и селезенки 49

  3. Различия в специфичности В-1а клеток селезенки и брюшной полости 51

2.4. Различия В-2 клеток селезенки и брюшной полости 52

  1. Миграция В лимфоцитов селезенки и брюшной полости 54

  2. Роль факторов перитонеального микроокружения в формировании различий В лимфоцитов селезенки и брюшной полости 57

2.7. Заключение 59

Часть 2. Экспериментальные исследования 63

Глава 3. Материалы и методы исследования 63

  1. Животные 63

  2. Антиген и иммунизация 63

  3. Спленэктомия 63

  4. Получение клеточных суспензий 64

  5. Подсчет числа живых и мертвых клеток 65

  6. Получение В-1 лимфоцитов 65

  7. Получение В-2 лимфоцитов 67

  8. Витальное окрашивание клеток CFDA-SE 68

  9. окрашивание клеток флуоресцентными антителами 69

  1. Культивирование клеток in vitro 70

  2. Адоптивный перенос клеток 71

  3. Клеточный иммуноферментный анализ (ELISPOT) 72

Глава 4. Результаты исследования 74

4.1. Сравнительная характеристика слеток селезенки и брюшной полости
мышей СВА и CBA/N 74

  1. Определение общего числа клеток в селезенке и брюшной полости мышей СВА и CBA/N 74

  2. Определение числа В и Т лимфоцитов в селезенке и брюшной полости мышей СВА и CBA/N 75

  3. Функциональная активность В лимфоцитов селезенки и брюшной полости мышей СВА и CBA/N 76

4.2. Распределение клеток мышейСВА в селезенке и брюшной полости
мышей CBA/N после внутривенного или внутрибрюшинного переноса 77

  1. Функциональная активность спленоцитов мышей СВА и CBA/N в селезенке мышей CBA/N 81

  2. Функциональная активность перитонеальных клеток мышей СВА в селезенке и брюшной полости мышей CBA/N 83

  3. Функциональная активность В-1 и В-2 лимфоцитов мышей СВА, перенесенных внутривенно мышам CBA/N 86

  4. Способность спленоцитов и клеток брюшной полости мышей СВА восстанавливать у мышей CBA/N ответ на поливинилпирролидон 86

  5. Функциональная активность спленоцитов мышей СВА в брюшной полости мышей CBA/N 90

  6. Функциональная активность пре-инкубированных in vitro перитонеальных клеток и спленоцитов мышей СВА перенесенных внутрибрюшинно мышам CBA/N 94

  1. Функциональная активность пре-инкубированных in vitro перитонеальных клеток мышей СВА, перенесенных мышам CBA/N внутрибрюшинно 95

  2. Функциональная активность пре-инкубированных in vitro спленоцитов СВА, внутрибрюшинно перенесенных мышам CBA/N... 97

4.9. Остаются ли в перитонеальной полости мышей CBA/N перенесенные
клетки мышей СВА, способные продуцировать IgM in vitro? 101

Глава 5. Обсуждение результатов 105

Выводы 117

Список литературы 118

Список сокращений

BCR — В-клеточный рецептор

Btk — Бруттон тирозинкиназа

CFDA-SE, CFSE — карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир

GALT — лимфоидные ткани слизистой оболочки кишечника

Ig — иммуноглобулин

TLR — Toll-подобный рецептор (toll-like recepror)

АОК — антитело-образующие клетки

АПК — антигенпрезентирующие клетки

ИГОК — иммуноглобулин-образующие клетки

ИЛ — интерлейкин

ЛПС — липополисахарид

ТЗ — тимус зависимый (антиген, ответ)

ТН — тимус независимый (антиген, ответ)

ФСБ — фосфатно-солевой буферный раствор

Введение к работе:

Актуальность проблемы

В лимфоциты — неотъемлемый компонент иммунной системы. Основная функция В клеток — образование антител к разнообразным эндогенным и экзогенным антигенам (Murphy К, 2008). Они также принимают участие в различных межклеточных взаимодействиях: презентации антигена, регуляции активности Т лимфоцитов, формировании структуры вторичных лимфоидных органов. В зависимости от происхождения, преимущественной локализации и спектра экспрессируемых специфичностей В лимфоциты подразделяют на 3 основные субпопуляции, различающиеся по своим свойствам: В-1, В-2 и В клетки маргинальной зоны (MZ-B) (Сидорова Е.В., 2006). В-1 лимфоциты, в свою очередь, подразделяются на CD5+ В-la и CD5" В-lb клетки. В клетки, принадлежащие к разным субпопуляциям, распределены в организме неодинаково. Большинство В-1 лимфоцитов сосредоточено в брюшной полости и lamina propria кишечника. В-2 клетки, напротив, локализованы преимущественно в селезенке, лимфатических узлах и кровотоке.

В настоящее время наиболее полно изучены В клетки селезёнки и брюшной полости. Установлено, что свойства В лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости различны. Долгое время считали, что различия обусловлены преобладанием в этих органах той или иной субпопуляции В лимфоцитов. В последние годы, однако, получены данные, свидетельствующие о различиях В клеток одной популяции, локализованных в разных органах. Более того, В лимфоциты, локализованные в одном органе, проявляют сходные свойства независимо от принадлежности к той или иной субпопуляции (Rothstein T.L., 2002; Hastings W.D., 2006).

Между селезенкой и перитонеальной полостью происходит постоянный обмен В клетками. При этом под влиянием разного микроокружения В лимфоциты теряют одни свойства и приобретают другие.

Например, изменяется экспрессия некоторых генов (Stoermann В., 2007; Berberich S., 2007) и способность В клеток отвечать на перекрестное связывание В-клеточного рецептора (Chumley M.J., 2002). Покидая брюшную полость, В клетки перестают экспрессировать поверхностный маркер Мас-1 (Hastings W.D., 2006); микроокружение перитонеальной полости коммитирует В клетки к миграции в лимфоидные ткани кишечника (Berberich S., 2007) и т.д.

Долгое время в научной литературе В спленоциты ассоциировали с В-2
субпопуляцией, а перитонеальные В лимфоциты с В-1; при этом основной
упор делали на изучение способности клеток селезенки и брюшной полости
восстанавливать у облученных и scid-мышей те или иные субпопуляции В
клеток. Функциональная активность В лимфоцитов в различном
микроокружении практически не изучалась. В настоящее время
опубликовано несколько работ, по исследованию способности
перитонеальных В лимфоцитов синтезировать/секретировать

иммуноглобулины (ИГ) in vivo. Хотя по этому вопросу нет однозначного мнения, большинство авторов считают, что в брюшной полости В клетки находятся в неактивном состоянии. Это удивительно, поскольку преобладающие в брюшной полости В-1 клетки являются источником >50% нормального IgM крови и составляют -50% IgA-продуцентов кишечника.

В настоящее время окончательно не установлено, какие факторы микроокружения перитонеальной полости влияют на активность В лимфоцитов. Не определено не меняется ли активность уже образующих ИГ В клеток при попадании их в микроокружение брюшной полости. Неизвестно с чем связано отсутствие ИГ-образующих клеток (ИГОК) в брюшной полости мышей — с неспособностью В клеток к активации или угнетением синтеза/секреции ИГ. Изучение этих вопросов необходимо для расширения наших представлений о межклеточных взаимодействиях и роли микроокружения в функционировании В клеток.

Цель исследования

Определение влияния микроокружения брюшной полости и селезенки на функциональную активность В лимфоцитов мыши.

Задачи исследования

  1. Отработка условий внутривенного и внутрибрюшинного переноса клеток селезенки и перитонеальной полости мышей СВА конгенным xid-мышам CBA/N.

  2. Выявление распределения перенесенных клеток мышей СВА в селезенке и брюшной полости мышей CBA/N.

  3. Определение влияния перитонеального микроокружения селезенки мышей CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости мышей СВА.

  4. Определение влияния микроокружения брюшной полости мышей CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов селезенки.

  5. Определение содержания ИГОК в брюшной полости спленэктомированных мышей CBA/N после внутрибрюшинного введения им спленоцитов СВА.

  6. Активация перитонеальных В лимфоцитов путем инкубации их in vitro.

  7. Разработка модели, позволяющей исследовать активность перитонеальных клеток СВА.

  8. Определение влияния микроокружения брюшной полости мышей CBA/N на синтез/секрецию IgM преинкубированными in vitro перитонеальными клетками мышей СВА.

Научная новизна Впервые исследовано распределение в селезенке и брюшной полости мышей CBA/N окрашенных CFDA-SE спленоцитов и перитонеальных клеток мышей СВА при их внутривенном и внутрибрюшинном переносе.

Впервые показано, что спленэктомия не влияет на содержание В и Т лимфоцитов в брюшной полости мышей CBA/N.

Впервые показано, что вводимые в брюшную полость ИГОК селезенки прекращают синтезировать/секретировать ИГ.

Впервые разработана экспериментальная модель, позволяющая исследовать функциональную активность перитонеальных В клеток в микроокружении брюшной полости.

Впервые показано, что при внутрибрюшинном переносе мышам CBA/N активированных in vitro перитонеальных В клеток мышей СВА образование ими ИГ угнетается.

Впервые показано, что после того, как перенесенные внутрибрюшинно перитонеальные ИГОК перестают синтезировать/секретировать ИГ, в брюшной полости реципиентов В клетки, способные продуцировать ИГ in vitro сохраняются.

Таким образом установлено, что микроокружение брюшной полости подавляет образование ИГ В лимфоцитами у мыши.

Практическая значимость

Настоящая работа относится к исследованиям фундаментального характера. Полученные данные о влиянии микроокружения брюшной полости и селезенки на функциональную активность В лимфоцитов расширяют наши представления о механизмах иммунитета. Вместе с тем, поскольку В-1 лимфоциты перитонеальной полости играют важную роль в защите организма от бактериальной инфекции, а также вносят существенный вклад в патогенез аутоиммунных и онкологических заболеваний, изучение влияния перитонеального микроокружения на свойства В клеток необходимо для более полного понимания механизмов регуляции активности В лимфоцитов, что может быть использовано при разработке новых схем лечения упомянутых заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

В отличие от селезенки, в перитонеальной полости мышей СВА и CBA/N in vivo IgM-образующие клетки отсутствуют.

В лимфоциты мышей СВА при адоптивном переносе конгенным xid-мышам CBA/N в организме реципиентов выживают и функционируют (синтезируют/секретируют ИГ).

При внутривенном введении мышам CBA/N окрашенных CFDA-SE клеток мышей СВА, в селезенке реципиентов удается выявить больше перенесенных клеток, чем в брюшной полости, а при внутрибрюшинном введении наоборот — в перитонеальной полости выявляется больше перенесенных клеток, чем в селезенке.

Неактивные в брюшной полости В лимфоциты мышей СВА образуют ИГ в селезенке мышей CBA/N. В то же время, спленоциты СВА в брюшной полости мышей CBA/N ИГ не образуют.

При внутрибрюшинном введении активированных перитонеальных клеток в брюшной полости реципиентов на 1-е сутки после переноса сохраняется ~30% перенесенных IgM-ИГОК; на 4-е сутки их число уменьшается до фоновых значений.

После «умолкания» перенесенных внутрибрюшинно ИГОК в перитонеальной полости реципиентов клетки, способные продуцировать ИГ сохраняются.

Микроокружение брюшной полости угнетает образование ИГ В лимфоцитами.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), Международном иммунологическом конгрессе (Рио-де-Жанейро, 2007), Объединённом иммунологическом форуме 2008 (Санкт-Петербург,

2008), конференции молодых ученых, посвященной 100-летию получения И.И. Мечниковым Нобелевской премии (Москва, 2008).

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ. Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 138 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 13 рисунками. Библиография включает 129 отечественных и зарубежных источников.


© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net