Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Медицинские науки
Иммунология и аллергология

Диссертационная работа:

Карташев Владимир Васильевич. Криптоспоридиоз у больныхВИЧ-инфекцией: клинико-экспериментальное и паразитологическое исследование : диссертация ... доктора медицинских наук : 14.00.10 / Карташев Владимир Васильевич; [Место защиты: ГОУВПО "Ростовский государственный медицинский университет"].- Ростов-на-Дону, 2009.- 301 с.: ил.

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

ВВЕДЕНИЕ 2

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА I. Биологические особенности криптоспоридий 15

  1. Биология криптоспоридий, история открытия и таксономия паразита 15

  2. Характеристика основных видов криптоспоридий, патогенных для человека 27

  3. Экспериментальный криптоспоридиоз у

Мышей SCID 38

1.4 Культивирование криптоспоридий in vitro 42

ГЛАВА П. Эпидемиология, лабораторная диагностика и особенности клинических проявлений криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией ... 44

  1. Эпидемиология криптоспоридиоза 44

  2. Лабораторные методы диагностики криптоспоридиоза 67

  3. Клинические проявления криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией 76

  4. Лечение криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией 93

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА III. Клиническая характеристика больных, объектов
окружающей среды и методов исследования 101

  1. Клиническая характеристика больных 101

  2. Лабораторные методы диагностики криптоспоридиоза 112

3.2.1 Метод прямой микроскопии испражнений 112

3.2.1 Окраска ооцист криптоспоридий в мазке испражнений

по методу Киньюн ПО

  1. Метод прямой иммунофлюоресценции 117

  2. Метод иммуномагнитной сепарации 118

3.3. Методика выделения ДНК, постановки полимеразной

цепной реакции (ПНР) и анализа полиморфизма длины

рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ-анализ) 123

  1. Метод экстракции ДНК 124

  2. Методика полимеразной цепной реакции — ПНР 127

  3. Методика анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ-анализ) 128

3.4 Методы исследования ооцист криптоспоридии в питьевой воде Ростовской городской системы водоснабжения и в воде

бассейна реки Дон и его притоков 131

3.4.1 Исследование ооцист криптоспоридии

в питьевой воде 134

3.4.2. Исследование ооцист криптоспоридии в воде

бассейна реки Дон и его притоков 138

3.5. Методы выделения, концентрации и очистки ооцист

криптоспоридии из испражнений 149

3.5.1. Метод предварительной очистки ооцист

из испражнений путем осаждения 149

3.5.2. Метод очистки и концентрации ооцист из испражнений
путем центрифугирования в градиенте плотности
раствора сахарозы и в градиенте плотности раствора
хлорида цезия 150

  1. Оценка жизнеспособности ооцист криптоспоридии по показателю их эксцистирования (освобождения спорозоитов) 157

  2. Оценка вирулентности ооцист криптоспоридии, выделенных из испражнений больных ВИЧ-инфекцией, на модели экспериментальной инфекции у мышей линии SCID 159

  3. Методика культивирования криптоспоридии in vitro в среде,

не содержащей клеток хозяина 163 .

3.9 Характеристика обследованных сельскохозяйственных
животных и птиц, хищников Ростовского зоопарка и дико
живущих лис 171

4
ГЛАВА IV. Результаты исследования 174

  1. Результаты сравнительной оценки чувствительности различных лабораторных методов диагностики криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией 174

  2. Клинические проявления и прогностическое значение криптоспоридиоза у больных на разных стадиях ВИЧ-инфекции 187

4.2.1 Клиническая характеристика криптоспоридиоза у
больных ВИЧ-инфекцией на момент

установления диагноза 187

4.2.2 Результаты наблюдения за больными ВИЧ-инфекцией с
криптоспоридиозом в отдаленном периоде 196

4.3 Результаты исследования биологических свойств
криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией 202

  1. Молекулярно-генетическая характеристика криптоспоридий, обнаруженных у больных ВИЧ-инфекцией 202

  2. Оценка жизнеспособности ооцист криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ инфекцией,

по показателю их эксцистирования 205

  1. Оценка вирулентности ооцист криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией, при экспериментальном заражении мышей SCID 208

  2. Оценка биологических свойств криптоспоридий по росту в культуре (в питательной среде,

не содержащей клеток хозяина) 211

4.4 Результаты исследования роли водного фактора передачи
криптоспоридиоза и резервуара паразита среди животных 218

4.4.1 Результаты исследования ооцист криптоспоридий

в питьевой воде 218

4.4.2 Результаты исследования ооцист криптоспоридий в воде
бассейна реки Дон и его притоков 220

4.4.3 Результаты исследования ооцист криптоспоридий в
испражнениях сельскохозяйственных животных, хищников
зоопарка и дико живущих лис 230

ГЛАВА V. Обсуждение результатов 235

Выводы 262

Практические рекомендации 263

Список литературы 265

Введение к работе:

Более ста лет назад Эрнест Эдвард Тизер (1875 — 1965) впервые обнаружил и описал нового паразита из класса споровиков (Е. Tyzzer, 1907). Автор дал название вновь открытому им паразиту «Cryptosporidium», т.к. в отличие от других споровиков его ооцисты не содержали спороцист, вместо них внутри ооцист располагались четыре спорозоита. Э. Тизеру также принадлежит еще один приоритет в отношении описанного им паразита, который был отнесен к категории оппортунистических, поскольку паразитирова-ние в железах слизистой оболочки желудка мышей, как установил автор, не приводило ни к каким клиническим проявлениям и сопровождалось едва заметными гистологическими изменениями.

С момента открытия Э. Тизера прошло около 70 лет прежде чем крип-тоспоридиоз был выявлен у человека. В 1976 году почти одновременно были опубликованы описания двух случаев болезни, один из них в форме энтероколита у ребенка с сохранным иммунитетом (F. Nime et al., 1976), другой - в виде обильной водной диареи у взрослого больного с иммунодепрессией (J.Meisel et al., 1976).

В целом 7 случаев криптоспоридиоза были опубликованы и суммированы в литературе к 1980 году, из них у 5 больных заболевание возникло на фоне иммунодепрессии (R. Bird, М. Smith, 1980). В связи с этим авторы отметили в своей публикации: «В тех случаях, когда иммунная система функционирует нормально, и нет никаких других фоновых поражений кишечника, криптоспоридиоз не представляет никаких проблем для здоровья и ориентировочно может рассматриваться как оппортунистический возбудитель». Эти слова были написаны в то самое время, когда стали регистрироваться первые случаи СПИД.

Уже через три года появилась первая статья, в которой были представлены 10 случаев криптоспоридиоза с затяжной водной диареей у больных СПИД гомосексуалистов (P. Ma, R. Soave, 1983). А еще через год число опи-

7 санных в литературе случаев криптоспоридиоза у больных СПИД достигло пятидесяти (Р. Ма, 1984). К концу 1984 года из числа всех описанных в литературе случаев криптоспоридиоза больные со СПИД составляли 83%, а 55% из них погибли (Т. Navin, D. Juranek, 1984).

Связь криптоспоридиоза со СПИД была настолько очевидной, что криптоспоридиоз стал одним из общепризнанных индикаторов СПИД задолго до открытия и описания самого вируса иммунодефицита человека. С начала эпидемии ВИЧ-инфекции и до сегодняшнего дня основная часть исследований, посвященных проблеме криптоспоридиоза, так или иначе были связаны с проблемой СПИД. Исследователей меньше интересовала проблема криптоспоридиоза у больных, находящихся на ранних стадиях ВИЧ-инфекции. Отчасти это было обусловлено тем, что предположение о крип-тоспоридиозе и целенаправленное обследование больных на криптоспоридиоз выполнялось только у больных ВИЧ-инфекцией при появлении диареи.

Больные ВИЧ-инфекцией на стадии СПИД подвержены особо тяжелым затяжным и хроническим формам криптоспоридиоза с обильной водной диареей, обезвоживанием и неблагоприятным прогнозом для жизни (S. Pitlik et al., 1983; С. Petersen, 1992; В. Ramratnam, Т. Flanigan, 1997; D. Clark, 1999; S. Caccio, 2005). Однако, почти одновременно с описанием злокачественных форм криптоспоридиоза у больных СПИД появлялись единичные публикации о более благоприятных клинических вариантах болезни со спонтанным выздоровлением и сообщения о ее бессимптомных формах (F. Zar et al., 1985; F. Zar, 1990; E. Janoff et al., 1990; D. Saltzberg et al., 1991; С Blanshard et al., 1992; R. Goodgame et al., 1993; I. McGowan et al., 1993; M. Pettoello-Mantovani et al., 1995; S. Chhin et al., 2006). Благоприятно протекающие формы любых болезней редко привлекают внимание врача.

Варианты клинического течения криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией напрямую зависят от степени выраженности иммунодепрессии (Т. Flanigan et al., 1992; Е. Pozzio et al., 1997). Единичные публикации последних лет свидетельствуют также и о том, что клинические проявления

8 криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией могут быть обусловлены биологическими свойствами отдельных видов и генотипов возбудителя (М. Messner et al., 2001; С. Chappell et al., 2006; V. Cama et al., 2007).

Важность проблемы криптоспоридиоза для больных ВИЧ-инфекцией неоднократно подчеркивалась и отечественными учеными (В.И. Покровский, В.В. Покровский, 1988; Н.А. Чайка, Т.В. Бейер, 1990; В.И. Покровский, Б.А. Годованный, 1995; В.В. Шкарин, С.Н. Соринсон, 1999; В.В. Покровский и др., 2000, 2003; Е.С. Белозеров, Е.И. Змушко, 2003; Ю.В. Лобзин и др., 2003; В.М.Волжанин, 2008). Однако специальные исследования по проблеме криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в России не выполнялись. Было опубликовано описание случая сочетанного течения криптоспоридиоза и туберкулеза у больного ВИЧ-инфекцией (Краченко А.В. и др., 1993). В монографии Л.П. Сизякиной с соавт. (2000), посвященной проблеме ВИЧ-инфекции у детей, приведены данные о частоте криптоспоридиоза среди наблюдавшихся авторами больных на стадиях пре-СПИД и СПИД — 5,7% и 11 %, соответственно.

Образовавшийся разрыв между информацией о криптоспоридиозе у больных ВИЧ-инфекцией за рубежом и отсутствием данных о состоянии этой проблемы у больных ВИЧ-инфекцией в России, а также важное значение проблемы криптоспоридиоза для больных ВИЧ-инфекцией определяют актуальность данного исследования.

Цель работы. На основе изучения эпидемиологии криптоспоридиоза в Ростове-на-Дону, особенностей его клинического течения у больных ВИЧ-инфекцией, методов лабораторной диагностики, и оценки биологических свойств паразита разработать программу диагностики и прогноза криптоспоридиоза у больных на разных стадиях ВИЧ-инфекции.

Задачи исследования:

1) исследовать чувствительность разных лабораторных методов диагностики криптоспоридиоза и установить частоту криптоспоридиоза

9 у больных с ВИЧ-инфекцией, дать клиническую характеристику криптоспоридиоза в зависимости от клинической стадии ВИЧ-инфекции, а также изучить влияние разных клинических форм криптоспоридиоза на динамику клинического течения и прогноз ВИЧ-инфекции;

  1. выполнить молекулярно-генетические исследования паразита и определить доминирующий вид криптоспоридий у больных ВИЧ-инфекцией в Ростове-на-Дону;

  2. исследовать биологические особенности паразита, в частности, жизнеспособность ооцист, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией с разными клиническими проявлениями криптоспоридиоза, провести оценку вирулентности криптоспоридий при экспериментальной инфекции у мышей лини SCID, а также потенциал роста на искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина;

  3. выполнить исследование ооцист паразита в питьевой воде городской системы водоснабжения Ростова-на-Дону, а также изучить содержание ооцист криптоспоридий в речной воде бассейна Нижнего Дона для оценки ее роли в эпидемиологии криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией;

  4. оценить потенциальную роль отдельных сельскохозяйственных животных и птиц как резервуара криптоспоридий и зоонозного источника инфекции для больных ВИЧ-инфекцией;

  5. на основе полученных данных разработать программу оптимизации клинико-лабораторной диагностики и прогноза течения криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией.

Научная новизна

Установлены преимущества иммунологических методов лабораторной диагностики криптоспоридиоза (прямая иммунофлюоресценция и иммуно-

10 магнитная сепарация) при обследовании больных ВИЧ-инфекцией над традиционными методами лабораторной диагностики (прямая микроскопия, окраска мазка испражнений по Циль-Нильсену). Эти преимущества характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью методов первой группы, которые позволили выявить высокую частоту бессимптомных формы болезни форм криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону.

Впервые установлена зависимость клинических проявлений и исходов криптоспоридиоза от клинической стадии ВИЧ-инфекции, а также отрицательное влияние хронического криптоспоридиоза на темпы прогрессирова-ния ВИЧ-инфекции уже на ее начальных стадиях.

Впервые в России выполнено генотипирование криптоспоридий, выделенных от больных ВИЧ-инфекцией и определен доминирующий вид паразита у больных ВИЧ инфекцией в Ростовской области — С. parvum.

Впервые в истории изучения криптоспоридиоза изучены биологические свойства криптоспоридий, обнаруживаемых в испражнениях больных ВИЧ-инфекцией. В частности, исследована жизнеспособность выделяемых с испражнениями больных ВИЧ-инфекцией ооцист по показателю активности эксцистирования и их вирулентность для мышей SCID, а также потенциал роста паразита на искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина.

Впервые выполнена эпидемиологическая оценка качества питьевой воды в г. Ростове-на-Дону и речной воды бассейна Нижнего Дона по содержанию в ней ооцист криптоспоридий, а также ^определен потенциал зоонозного резервуара инфекции среди сельскохозяйственных животных, которым является крупный рогатый скот.

Практическая значимость

Разработана программа клинико-лабораторной диагностики и оценки прогноза криптоспоридиоза у больных ВРІЧ-инфекцией в зависимости от ее стадии.

Расширены показания к лабораторному обследованию больных ВИЧ-инфекцией на криптоспоридиоз. Рекомендованы методы лабораторной диагностики криптоспоридиоза, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью, что повышает вероятность его распознавания у больных ВИЧ-инфекцией.

Изучены биологические особенности криптоспоридий, обнаруженных в испражнениях больных ВИЧ-инфекцией, выполнена оценка их жизнеспособности, потенциал роста при культивировании в искусственной питательной среде, не содержащей клеток хозяина, разработана модель оценки вирулентности паразита на экспериментальной модели инфекции у мышей SCID.

Показано, что клинические проявления и исход криптоспоридиоза варьируют в зависимости от клинической стадии ВИЧ-инфекции, вероятность выздоровления существует только у больных на ранних стадиях ВИЧ-инфекции. Установлено отрицательное влияние криптоспоридиоза на темпы прогрессирования ВИЧ-инфекции даже на ранних клинических стадиях при отсутствии выраженного иммунодефицита. При выявлении криптоспоридиоза у больного ВИЧ-инфекцией следует его в число первоочередного кандидата для проведения высоко активной антиретровирусной терапии.

Установлен доминирующий вид паразита, являющийся возбудителем криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией, естественный резервуар инфекции в природе, показано, что вода не является основным путем передачи инфекции.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. При использовании высоко чувствительных методов лабораторной диагностики выявлена высокая частота криптоспоридиоза у больных

12 ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону, который характеризуется на ее ранних стадиях значительным удельным весом легких и бессимптомных форм.

  1. ВИЧ-инфекция и криптоспоридиоз оказывают взаимное отягчающее влияние. Отрицательное влияние ВИЧ-инфекции проявляется на поздних стадиях болезни и характеризуется увеличением удельного веса клинически проявляющихся и хронических форм криптоспоридиоза. Отрицательное влияние криптоспоридиоза выражается в ускорении темпов прогрессирования ВИЧ-инфекции у больных с хронической формой болезни, сопровождающейся диареей.

  2. Доминирующим видом возбудителя криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону является С. parvum, что является свидетельством преимущественно зоонозного резервуара и источника инфекции.

  3. Экспериментальная инфекция у мышей SCID является наиболее чувствительной моделью оценки вирулентности криптоспоридий, выделенных из испражнений больных ВИЧ-инфекцией (с учетом видовой принадлежности обнаруженного паразита, представленного С. parvum), показатель эксцистирования ооцист и рост криптоспоридий на искусственной питательной среде не обладают такой чувствительностью.

  4. Питьевая вода не является ведущим фактором передачи криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией в г. Ростове-на-Дону.

  5. Основным естественным резервуаром инфекции в природе является крупный рогатый скот.

Внедрение в практику

Материалы диссертации внедрены:

  1. в работу Областного центра по борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями в Ростовской области;

  2. в работу Южного Окружного центра СПИД;

  1. в учебный процесс на кафедре инфекционных болезней РостГМУ Росздрава;

  2. по теме диссертации опубликованы 26 работ;

  1. оформлена заявка на патент «Питательная двухфазная среда для культивирования микроорганизмов» (№ 2009103545, приоритет от 03.02.2009);

  2. подготовлены и опубликованы «Методические указания по лабораторной диагностике криптоспоридиоза у больных ВИЧ-инфекцией» для инфекционистов и врачей клинических лабораторий (Ростов-на-Дону, 2008 г.).

Апробация работы

Основные результаты исследования представлены на научных конференциях: «Developing Research for a Common Future. The 2nd German-Russian Cooperative Symposium, 4-8 June, 2002» (Rostov-on-Don, Russia, 2002); «IWA Symposium on Health-Related Water Microbiology, 14-19 September, 2003» (Cape Town, South Africa, 2003); «Improving Research for a Common Future. The 3rd German-Russian Cooperative Symposium, 29-31 May, 2004» (Cologne, Germany, 2004); « The 3rd Congresss of German-Greek Academy for Biomedi-cine, 29-31 May, 2004» (Kavala, Greece, 2004); « The Fourth International Giardia Conference and the First Combined Giardia/Crypto Meeting in Amsterdam, 20-24 September, 2004» (Amsterdam, Netherlands, 2004); «The 15th Japanese-German Symposium on Protozoan Diseases, 16-21 September, 2006» (Obi-hiro, Hokkaido, Japan, 2006). The 4-th German-Russian Cooperative Symposium, 6-10 June, 2006» (Rostov-on-Don, Russia, 2006). I Съезд инфекционистов ЮФУ (Краснодар, 2008). The 5-th German-Russian Cooperative Symposium, 14-17 June, 2008» (Cologne, Germany, 2008). Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы», IV Международная конференция по иммунотерапии (Москва, 2008).

14 Публикации

Основные результаты диссертации представлены в 26 работах, в том числе в 9 изданиях, включенных в перечень рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 337 страницах машинописного текста и состо-" ит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 668 источников, из которых 34 опубликованы на русском языке и 634 — на иностранных языках. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 37 рисунками.

15 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ


© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net