Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Медицинские науки
Космическая медицина

Диссертационная работа:

Гершович Юлия Геннадьевна. Морфофункциональное состояние и дифференцировочный потенциал культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации : диссертация ... кандидата биологических наук : 14.00.32, 03.00.25 / Гершович Юлия Геннадьевна; [Место защиты: Ин-т мед.-биол. проблем].- Москва, 2009.- 187 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/1023

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Понятие стволовой клетки и клетки-предшественника
1.1.1. Биология мультипотентных мезенхимальных стромальных

клеток (ММСК) 12

1.2. Фенотипические и функциональные свойства ММСК

1.2.1. Морфологические особенности и характеристика роста ММСК

в культуре 17

  1. Особенности иммунофенотипа и аутокринные факторы, вырабатываемые ММСК 20

  2. Дифференцировочный потенциал ММСК 27

1.3. Возможные механизмы реализации влияния

гравитационного фактора на уровне клетки 41

1.3.1. Остеобластический клеточный фенотип в условиях микрогравитации 44

1.3.1.1. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на
культивируемые клетки остеобластического фенотипа и остеогенные
клетки-предшественники 49

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56

2.1. Культуры клеток

  1. Химические реактивы, культуральные среды, посуда 56

  2. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток,

выделенных из костного мозга человека 57

2.1.3. Криоконсервация ММСК костного мозга человека 57

2.2. Исследование свойств культур ММСК человека и дифференцированных
производных ММСК в условиях моделирования эффектов
микрогравитации с помощью различных систем

2.2.1. Схема эксперимента и экспериментальные группы 58

2.2.2. Индукция и детекция остеогенной дифференцировки ММСК

костного мозга человека 59

  1. Рост клеток 60

  2. Определение активности щелочной фосфатазы 60

  3. Иммуноцитохимическое выявление коллагена I типа 61

  4. Гистохимическая идентификация кальциевых депозитов 61

  5. Исследование иммунофенотипа МСК и остеогенных производных

с помощью проточной цитофлюориметрии. Определение экспрессии
мембранной формы щелочной фосфатазы 62

  1. Исследование количественного содержания цитокинов в среде культивирования 64

  2. Индукция и детекция адипогенной дифференцировки ММСК костного мозга человека 65

2.2.9.1. Выявление липидных капель 66

2.3. Статистическая обработка данных 66

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 67

3.1. Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальные
клеток костного мозга человека (пролиферативная активность,
иммунофенотип, продукция интерлейкинов,

дифференцировочный потенциал) 67

3.2. Влияние клиностатирования на морфофункциональное состояние

ММСК и остеогенных производных ММСК костного мозга человека 75

3.2.1. Влияние клиностатирования на рост

клеток 75

  1. Влияние клиностатирования на иммунофенотип клеток 81

  2. Влияние клиностатирования на продукцию интерлейкинов 84

3.3. Влияние клиностатирования на остеогенный дифференцировочный
потенциал ММСК и остеогенных клеток-предшественников 87

  1. Влияние клиностатирования на индуцированную активность щелочной фосфатазы 87

  2. Органические и неорганические компоненты костного матрикса в культурах остеогенных производных ММСК при клиностатировании 90

3.4. Влияние клиностатирования на адипогенный

дифференцировочный потенциал ММСК 94

3.5. Морфофункциональное состояние ММСК и остеогенных производных
ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации

с помощью RPM 98

  1. Рост клеток при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM 98

  2. Иммунофенотип клеток при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM 103

  3. Продукция интерлейкина-8 при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM 106

3.6. Остеогенный дифференцировочный потенциал ММСК и
остеогенных клеток-предшественников в условиях моделирования

эффектов микрогравитации с помощью RPM 109

3.6.1. Активность щелочной фосфатазы при моделировании эффектов
микрогравитации с помощью RPM 109

3.6.2. Органические и неорганические компоненты костного матрикса в
культурах остеогенных производных ММСК при моделировании
эффектов микрогравитации с помощью RPM 115

3.7. Адипогенный дифференцировочный потенциал ММСК и адипогенных
производных ММСК в условиях моделирования эффектов
микрогравитации с помощью RPM 123

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 127

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 155

ВЫВОДЫ 160

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 161

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 162

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГСК Гемопоэтические Стволовые Клетки

ИЛ Интерлейкин

ММСК Мультипотентные Мезенхимальные Стромальные Клетки

КП космический полет

ЩФ Щелочная Фосфатаза

ФБД Фосфатно-Солевой Буфер Дальбекко

ЭСК Эмбриональные Стволовые Клетки

BMP Костный Морфогенетический Белок

CD Кластер Дифференцировки

FAK Киназа Фокальной Адгезии

FGF Фактор Роста Фибробластов

FITC Флюоресцин-изотиоционат

EGF Эпидермальный Фактор Роста

IGF Инсулиноподобный Фактор Роста

МАРК Митоген-Активируемые Протеинкиназы

МРР Матриксные Металлопротеиназы

N0 Оксид Азота

РЕ Фикоэритрин

PGE2 Простагландин Е2

PPAR)>2 Peroxisome Prohferator-Activated Receptor yl

Runx2 Runt-Related Transcription Factor 2

TGF Трансформирующий Фактор Роста

RPM Random Positioning Machine

RT комнатная температура

Введение к работе:

Актуальность проблемы. Результаты, полученные в условиях космического полета и в модельных экспериментах, неоспоримо свидетельствуют о том, что костная система не может неизменно функционировать в условиях микрогравитации. Совокупность зарегистрированных физиологических изменений включает отрицательный баланс кальция, общую потерю массы костной ткани, деминерализацию в костях, несущих осевую опорную нагрузку на Земле, увеличение содержания в крови и моче маркеров костной резорбции [Ступаков, Воложин, 1989; Григорьев, Воложин, Ступаков, 1994; Газенко, Григорьев, Егоров, 1997; Оганов, 2003; Collet et al., 1997; Caillot-Augusseau et al., 1998; Vico et al., 2001]. Очевидно, что этот факт может существенно лимитировать продолжительность пребывания человека в космическом пространстве из-за потенциального риска развития остеопороза и сопровождаться негативными последствиями при возвращении в условия земной гравитации. Тем не менее, клеточные механизмы наблюдаемых изменений до настоящего времени остаются не до конца ясными. Работы, выполненные в течение ряда последних лет, убедительно продемонстрировали, в том числе, и чувствительность культивируемых клеток остеобластического фенотипа к гравитационному фактору [Guignandon et al., 1995; Hughes-Fulford et al., 1996; Carmeliet et al., 1997; Kumei et al., 1998; Akiyama et al., 1999; Kacena et al.,2003; Hughes-Fulford et al., 2006; Kumei et al., 2006; Kumei et al., 2007]. Однако с увеличением количества экспериментальных данных перед исследователями встает новый вопрос: как может влиять микрогравитация или ее эффекты на различные аспекты функционирования менее зрелых клеточных форм, а именно на остеогенные клетки-предшественники и стволовые клетки. В постнатальном развитии основным источником стволовых клеток является костный мозг [Фриденштейн и др., 1976, 1981]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), локализованные в костном мозге и ряде других тканей и органов, способны к направленной дифференцировке в клеточные элементы костной, хрящевой и жировой тканей [Prockop, 1997; Jaiswal et al., 1997; Johnstone et al., 1998; Pittenger et al., 1999; Conget, Minguell, 1999; Muraglia et al., 2000; Janderova et al., 2003], а также клетки стромы, поддерживающей и регулирующей гемопоэз [Majumdar et al., 2003; McNiece et al., 2004; Maitra et al., 2004; Wagner et al., 2007]. Интерес к ММСК непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении вовлеченности ММСК в процессы самовозобновления и самоподдержания соединительных тканей и особенностей функционирования этих клеток in vitro и in vivo. Определение роли гравитационного фактора в морфофункциональном состоянии клеток-предшественников представляется важной, но не простой задачей. Механизмы влияния микрогравитации на клетку могут быть определены только в дорогостоящих космических исследованиях, временные рамки и методологические возможности которых чаще всего ограничены. В наземных условиях эффекты воздействия микрогравитации на клетку моделируют с помощью различных экспериментальных систем [Albrecht-Buehler, 1992; Moore, Cogoli, 1996; van Loon, 2007]. Тем не менее, исследования, посвященные изучению гравитационной чувствительности ММСК in vitro, крайне немногочисленны, затрагивают какие-то отдельные характеристики клеток-предшественников, временные экспозиции клеток в данных системах не превышают нескольких суток культивирования, а результаты, полученные при использовании различных моделей, зачастую противоречивы [Zayzafoon et al., 2004; Meyers et al., 2004; Meyers et al., 2005; Buravkova et al., 2005; Yuge et al., 2006; Dai et al., 2007]. Таким образом, дальнейшее комплексное исследование морфофункционального состояния и дифференцировочного потенциала ММСК в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации позволит приблизиться к более глубокому пониманию процессов, происходящих в ходе физиологического и патологического ремоделирования костной ткани, а также пролить свет на проблему механочувствительности стволовых клеток взрослого организма.

Цель работы: Изучение морфофункционального статуса и дифференцировочного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека in vitro в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации с помощью различных экспериментальных установок.

В соответствии с данной целью были поставлены следующие

задачи исследования:

1) Подобрать оптимальные условия культивирования и индукции дифференцировки ММСК в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации, создаваемых с помощью горизонтального клиностата и Random Positioning Machine (Устройство для рандомизации положения, RPM);

2) Исследовать влияние моделирования эффектов микрогравитации на начальные стадии роста ММСК в норме и при их коммитировании к остеогенезу;

3) Провести иммунофенотипическую характеристику ММСК и остеогенных ММСК-производных после длительной экспозиции в условиях моделирования эффектов микрогравитации;

4) Изучить продукцию некоторых интерлейкинов в культурах ММСК и остеогенных ММСК-производных при моделировании эффектов микрогравитации;

5) Проанализировать эффективность начальных и конечных этапов индуцированной остеогенной дифференцировки ММСК и их остеогенных производных в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации;

6) Оценить эффективность индуцированной адипогенной дифференцировки ММСК и их адипогенных производных при длительном моделировании эффектов микрогравитации.

Научная новизна.

Впервые проанализировано влияние длительного (от 10 до 30-40 суток) моделирования эффектов микрогравитации с помощью двух различных наземных экспериментальных установок (горизонтальный клиностат и Random Positioning Machine – RPM) на основные характеристики ММСК костного мозга человека и производные от них коммитированные остеогенные клетки-предшественники, которые отражают морфофункциональное состояние культивируемых клеток. Получены новые данные, свидетельствующие о гравитационной чувствительности стволовых клеток взрослого организма и низкодифференцированных остеогенных клеток-предшественников. Впервые показано, что длительная экспозиция ММСК и остеогенных клеток-предшественников различного уровня коммитированности на горизонтальном клиностате или RPM подавляет клеточный прирост на начальных этапах воздействия, не влияя при этом на жизнеспособность клеток. Обнаружено, что длительное моделирование эффектов микрогравитации не оказывает влияния на экспрессию основных иммунофенотипических маркеров ММСК и производных от них остеогенных клеток (CD90, CD29, CD44), однако стимулирует выработку провоспалительного цитокина (ИЛ-8). Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что в отличие от клиностатирования, которое оказывает незначительное влияние на завершающие этапы дифференцировки ММСК в остеогенном направлении, моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM подавляет как начальные (активация экспрессии мембранной формы щелочной фосфатазы, биосинтез коллагена I типа), так и терминальные этапы (формирование минерализованного матрикса) индуцированного остеогенеза остеогенных клеток-предшественников. Впервые показано, что в данных экспериментальных условиях направленная адипогенная дифференцировка культивируемых ММСК и полученных из них коммитированных адипогенных клеток-предшественников не изменяется.

Полученные данные расширяют сложившиеся теоретические представления о восприимчивости стволовых клеток и коммитированных остеогенных клеток-предшественников к изменению параметров гравитационной среды в условиях in vitro.

Научно-практическая значимость работы.

Результаты, полученные в работе, могут служить основой для использования низкодифференцированных стромальных клеток костного мозга человека, а также производных от них коммитированных клеток-предшественников в качестве удобной экспериментальной модели для изучения процессов дифференцировки клеток-предшественников в условиях изменения параметров гравитационной среды, а также механизмов клеточной механочувствительности.

Подтверждена потенциальная возможность включения стволовых клеток и низкодифференцированных остеогенных клеток-предшественников в развитие локальных клеточных процессов адаптивной перестройки костной ткани, наблюдаемых в условиях гипокинезии и микрогравитации.

Проведенные сравнительные исследования позволяют рекомендовать использование коммерческой экспериментальной установки RPM как более адекватной модели для предупреждения процессов индуцированной остеогенной дифференцировки стволовых клеток по сравнению с клиностатом. Результаты исследования могут быть использованы в материалах лекций по биологии стволовых клеток, авиационной, космической и морской медицине, а также учитываться при проведении биологических исследований.

Положения, выносимые на защиту:

I) Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, как и производные от них остеогенные клетки-предшественники, восприимчивы к моделированию эффектов микрогравитации, что подтверждается подавлением процессов клеточного роста и остеогенной, но не адипогенной дифференцировки клеток различного уровня коммитированности, а также активацией продукции интерлейкина-8.

II) Для изучения морфофункционального состояния и процессов коммитирования стволовых клеток в условиях измененной гравитации способ моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM имеет преимущество перед горизонтальным клиностатированием, поскольку оказывает влияние не только на морфофункциональные характеристики ММСК, но более существенно воздействует на остеогенную дифференцировку клеток-предшественников.

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации доложены на VI и VII конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2007, 2008); XXII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». (Пущино, 2008). V Международном Симпозиуме «Актуальные проблемы биофизической медицины» (Киев, 2007); I школе-конференции «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), 28th Annual International Gravitational Physiology Meeting. (Сан-Антонио, США, 2007); 29th Annual International Gravitational Physiology Meeting (Анже, Франция, 2008). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 27.04.2009 г. Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №06-04-49781-а, гранта Президента Российской Федерации «Ведущие научные школы» НШ-3402.2008.4 и программы Фундаментальных исследований ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 187 страницах, иллюстрирован 34 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 300 цитируемых источников, из которых 40 на русском и 260 на иностранном языке.


© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net