Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Медицинские науки
Трансплантология и искусственные органы

Диссертационная работа:

Степанова Ольга Ивановна. Трансплантация клеток костного мозга для коррекции патогенетических нарушений при сахарном диабете 2 типа : экспериментальное исследование : диссертация ... кандидата биологических наук : 14.00.41, 14.00.16 / Степанова Ольга Ивановна; [Место защиты: Федер. науч. центр трансплантологии и искусственных органов им. В.И. Шумакова].- Москва, 2009.- 184 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/784

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

ВВЕДЕНИЕ 6

Глава I. Современные представления о патогенезе сахарного диабета 2 типа
и способах его коррекции (обзор литературы) 15

1.1. К патогенезу инсулиннезависимого сахарного диабета и его
осложнений |..'. 16

  1. Современные методы медикаментозной терапии инсулиннезависемого сахарного диабета 27

  2. Клеточные технологии в коррекции клинических проявлений сахарного диабета 32

  1. Терапия фетальными, неонатальными и взрослыми островковыми клетками поджелудочной железы 33

  2. Коррекция стволовыми клетками 37

Глава П. Материалы и методы исследования 50

2.1. Характеристика экспериментального материала 50

2.2.Технология проведения культуральных исследований 56

  1. Получение и ведение культур гемопоэтических клеток костного мозга (мононуклеарной фракции) 56

  2. Получение и ведение культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга 58

  3. Получение первичной смешанной культуры клеток костного мозга1 (без фракционирования и культивирования) 61

  4. Подготовка клеточного материала для трансплантации 62

2.3. Методы исследования 63

  1. Методы биохимического исследования крови 63

  2. Методы морфологического исследования органов 65

  3. Метод исследования гистосовместимости доноров и реципиентов...69

2.4. Методы статистической обработки 70

Глава III. Мутантные мыши линии C57BL/KsJYLeprdb/+ - генетическая
модель сахарного диабета 2 типа 70

  1. Клиническая и биохимическая характеристика генетической модели сахарного диабета 2 типа у мутантных мышей линии B/Ks-Leprdb/+ 70

  2. Морфологические изменения в паренхиме внутренних органов при

сахарном диабете 2 типа у мутантных мышей линии B/Ks-Lepr /+ 75

Глава IV. Трансплантация клеток костного мозга при сахарном диабете 2
типа на стадии выраженных патогенетических нарушений в организме
(введение ККМ на 3 и 4 месяце после рождения) 84

4.1. Динамика показателей клинического состояния животных с сахарным

диабетом 2 типа после введения аллогенных клеток костного мозга 84

4.1.1. Результаты однократного введения аллогенных клеток костного мозга

черезЗмесяца после их рождения 84

4.1.21 Результаты многократного введения аллогенных клеток костного
мозга мышам с сахарным диабетом.через 4 месяца после их рождения 89

4.2. Динамика показателей клинического состояния животных с сахарным-
диабетом 2 типа после введения изогенных клеток костного мозга 95"

4.3. Влияние клеток- костного мозга* на коррекцию морфологических
изменений в паренхиме внутренних органов у мышей с генетической

моделью сахарным диабетом 2 типа 102

Глава V. Трансплантация клеток костного' мозга при сахарном диабете 2
типа на начальной стадии формирования патогенетических нарушений в
организме (введение клеток костного мозга на 30-35 день после
рождения) 126

5.1. Динамика показателей клинического состояния животных с
генетической моделью сахарным диабетом 2 типа 126

5.2. Морфологическая характеристика- паренхимы, внутренних органов у
мышей с генетической моделью сахарным диабетом 2 типа на фоне раннего
введения алло- или изогенных клеток костного мозга (через 30-35 суток
после рождения) 134

Глава VI. Обсуждение полученных результатов 144

Выводы 156

Практические рекомендации 158

Литература 159

5 Список сокращений, принятых в тексте

Г - глюкоза

ГПККМ - гемопоэтические клетки костного мозга

ИБС — ишемическая болезнь сердца

И - инсулин

ИНСД - инсулин независимый сахарный диабет

ИР — инсулинорезистентность

ККМ — клетки костного мозга

КМ - костный мозг

ЛП - липопротеиды

ЛПЛ — липопротеинлипаза

ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП - липопротеиды высокой, низкой, очень низкой

плотности

МНК - мононуклеарные клетки

ММСК КМ - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

костного мозга (фибробластоподобные клетки)

МСК — мезенхимальные стволовые клетки

ОК - островковые клетки

ОЛ - островки Лангерганса

ОХ - общий холестерин

ПЖ - поджелудочная железа

СД - сахарный диабет

СЖК — свободные жирные кислоты

СК— стволовые клетки

ТрГ - триглицериды

FGFb — основной фактор роста фибробластов

HbAlc — гликозилированный гемоглобин

PBS - фосфатно-буферный раствор

STZ - стрептозотоцин

Введение к работе:

Актуальность темы исследования.

Успехи клеточной биологии последних десятилетий создали научные и практические предпосылки для развития новой области медицины - клеточной трансплантации. С разработкой учения о стволовых клетках появилась надежда на возможность более эффективной регуляции процессов восстановительной регенерации

поврежденных органов и тканей [Pittenger etal., 1999; Jaiswal et.al., 2000;B.A. Отеллин, 1999; И.В. Потапов и др., 2001; М.Ф. Расулов, 2004],а также восстановления липидного, углеводного и белкового обменов [А.В. Берсенев, 2003; Hess et al., 2003; Ende et al., 2002] в организме с помощью аутологичных или аллогенных стволовых клеток костного мозга (ККМ). Особенно значимой возможность осуществления восстановительной регенерации могла бы быть для повышения эффективности лечения сахарного диабета (СД), который является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний, приводящих к глубокой инвалидизации и гибели людей трудоспособного возраста во всех странах мира [King Н. et al., 1998; Mainous et al., 2004; И.Й. Дедов и др., 2005]. Полагают, что особенно выраженный рост заболеваемости СД в наступающем тысячелетии будет иметь СД 2 типа в связи с прогрессирующим эпидемическим распространением в человеческой популяции факторов, предрасполагающих к его развитию: атеросклероза, проатерогенных метаболических синдромов и эндокринных нарушений [М.И. Балаболкин, Е.М. Клебанова и др., 2000; А.А. Александров, 2001; И.И. Дедов, М.В. Шестакова, 2003; ЯЛ. Александровский, 2005; И.Н. Бокарев и др., 2006]. Продолжающийся рост заболеваемости СД, несмотря на определенные достижения последних лет, свидетельствует о том, что ни профилактические мероприятия, ни современная медикаментозная терапия не способны надежно препятствовать возникновению и прогрессированию клинических проявлений СД и его осложнений. Поэтому поиск и разработка новых подходов к лечению СД остается актуальной проблемой современной медицины.

Приступая к своим исследованиям, мы полагали, что применение стволовых и прогениторных клеток костного мозга может оказаться особенно перспективными для лечения СД 2 типа, при котором инсулинорезистентная гипергликемия является первично мембранной патологией клеток и обусловлена конформационным изменением структуры мембран клеток в условиях развития дислипидемии и эндокринных расстройств. [М.И. Балаболкин, 1994; А.Ш. Зайчик, Л.П. Гурилов, 2001; И.Н. Бокарев, Б.К. Великое и др., 2006]. Мы полагали также, что для лечения СД 2 типа

4 наиболее перспективным может оказаться использование, как стромальной, так и мононуклеарной (гемопоэтической) фракций ККМ, которые содержат значительное количество стволовых и прогениторных клеток и поэтому способны индуцировать в паренхиме поврежденных органов процессы репаративной регенерации, выделяя в процессе своей жизнедеятельности регуляторные пептиды, которые восполняют дефицит адекватных информационных и адаптационных сигналов регенерации [НА. Онищенко, 2004; Kinnaird et al., 2004].Однако исследований по коррекции ККМ нарушений при СД 2 типа ни в клинике, ни в эксперименте мы не обнаружили. Только в одной из работ [Ende et al.,2004] приводятся сведения об однократном введении ретроорбитально большой дозы ксеногенных ККМ мышам без изучения влияния различных доз и типов ККМ, а также стадии развития болезни на результаты клеточной терапии. Одной из причин отсутствия в России исследований терапии СД 2 типа с помощью клеточных технологий, является отсутствие в нашей стране охарактеризованной модели СД 2 типа, развивающейся у мутантных мышей линии C57BL/KsJYLeprdb/+. Отсутствие патофизиологической характеристики течения СД 2 типа у мутантных мышей этой линии и отсутствие данных об изменениях клинических проявлений СД 2 типа у таких мышей под влиянием аллогенных или изогенных ККМ позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение целесообразности использования мутантных мышей линии C57BL/KsJYLeprdb/+ в качестве модели при проведении экспериментальных работ по коррекции сахарного диабета 2 типа методом трансплантации клеток костного мозга.

Для достижения указанной цели нами были поставлены следующие задачи;

1. Изучить динамику возникновения клинических и морфологических
нарушений, присущих СД 2 типа у мутантных мышей линии C57BL/KsJYLeprdb/+ и
обосновать пригодность использования их в качестве экспериментальной модели СД 2
типа для оценки терапевтической эффективности клеток костного мозга

2. Отработать методы выделения, культивирования или трансплантации
гемопоэтической и стромальной фракций клеток костного мозга для выбора
эффективного способа коррекции патогенетических нарушений при СД 2 типа.

3. Оценить эффективность и безопасность трансплантации аллогенного и
изогенного костного мозга при коррекции метаболических нарушений у животных с
СД 2 типа.

  1. Установить сроки применения клеток костного мозга в зависимости от стадии развития болезни, а также дозу и кратность их введения для пролонгированной коррекции клинических и метаболических (биохимических) нарушений, развивающихся при СД 2 типа.

  2. Установить значение фенотипа клеток костного мозга (гемопоэтической или стромальной фракций клеток), а также их гистосовместимости (изогенные и аллогенные клетки от здоровых животных) для индукции процессов репаративной регенерации внутренних органов (островковая ткань поджелудочной железы, печень, почки, лимфоидная ткань), участвующих в патогенезе СД 2 типа.

  3. Выявить наличие функционально активных трансплантированных клеток костного мозга (маркер- GFP) в органах животных с СД 2 типа на длительных сроках наблюдения (120 дней) и установить связь присутствия жизнеспособных клеток с восстановлением функции поврежденных органов.

Выполнение работы осуществлялась в рамках государственного контракта № 02.435.11.3019 от «02»сентября 2005г. «Использование стволовых клеток костного мозга для поддержания функции сердца и поджелудочной железы», по заказу Минздравсоцразвития РФ (регистрационный номер 0120.0800280) и а также в рамках отраслевой программы «Новые клеточные технологии - медицине» (01.07.2002-01.07.2010гг.), утвержденной 29.05.02г. на заседании президиума РАМН.

Научная новизна работы.

Впервые была изучена и охарактеризована патофизиологическими методами генетическая модель СД 2 типа на мутантных мышах линии C57BL/KsJYLeprdb/+, пригодная для изучения терапевтических эффектов клеток костного мозга. Полученная модель СД 2 типа в настоящее время поддерживается в ГУ НЦБМТ РАМН.

Было установлено, что развитие патологического процесса у этих мышей проходит 3 стадии: 1-я стадия (1-2 месяц со дня рождения) характеризуется гипергликемией на фоне гипертрофии и гиперплазии островков Лангерганса в поджелудочной железе (инсулинрезистентная); 2-я стадия (3-4 месяца со дня рождения) - характеризуется нарушением липидного (ожирение) и углеводного (гипергликемия) обменов и протекает на фоне снижения количества функционирующих (3-клеток в островках Лангерганса. На этой стадии возникают выраженные метаболические нарушения, сопровождающиеся структурными изменения внутренних органов. 3-я стадия (5-6 месяцы после рождения) СД 2 типа сопровождается кахексией, функциональными

нарушениями во внутренних органах, которые прогрессируют и приводят к гибели животного.

Доказано, что эффективность коррекции патофизиологических нарушений у животных с СД 2 типа при трансплантации клеток костного мозга, находится в прямой зависимости введенных клеток от суммарной дозы и стадии развития патологического процесса в организме, но не зависит от использованного фенотипа клеток и их гистосовместимости.

Показана целесообразность трансплантации клеток костного мозга на поздней стадии развития СД 2 для снижения темпов прогрессирования патоморфологических изменений во внутренних органах и пролонгирования сроков жизни животных.

Более выраженная эффективность от трансплантации клеток костного мозга показана на ранней стадии развития СД 2 типа, когда лучше сохранены резервы адаптации островковых клеток поджелудочной железы, выраженность которых регулируется введенными клетками костного мозга от здоровых животных.

Показано, что нормализация углеводного обмена при использовании клеток костного мозга на ранних сроках СД происходит на фоне активации процессов адаптации и регенерации островковой ткани поджелудочной железы, что подтверждено иммуногитохимически по окраске хромогранином-А на присутствие нейроэндокринных клеток в островках и по окраске на антитела Ki-67 - маркер репликации ДНК (пролиферативной активности клеток), а также по результатам гистологических и морфологических исследованиям (гипертрофия, гиперплазия).

Доказано, что предварительное культивирование трансплантируемых клеток костного мозга достоверно повышает эффективность коррекции метаболических и структурных нарушений изменений во внутренних органах у животных с СД 2 типа.

Показано, что аллогенные донорские клетки костного мозга линии мышей B10.GFP, длительно сохраняют свою жизнеспособность в организме реципиента (линия C57BL/KsJYLepr /+) по крайне мере в течение 120 дней после трансплантации и могут участвовать в регуляции восстановительного морфогенеза внутренних органов (печень, почки, поджелудочная железа, лимфоидная ткань).

Практическая значимость работы.

Патофизиологические характеристики мышей мутантной линии C57BL/KsJYLeprdb/+, полученной в ГУ НЦБМТ РАМН, пригодны для изучения патологических процессов, возникающих при развитии СД 2 типа.

Было доказано, что данные животные (C57BL/KsJYLeprdb/+) могут быть использованы в качестве экспериментальной модели при проведении исследований с целью коррекции метаболических нарушений при СД 2 типа методами клеточной терапии.

Трансплантация аллогенных или изогенных клеток костного мозга при коррекции метаболических нарушений, сопровождающих развитие СД 2 типа, является безопасной процедурой, ослабляющей клинические и морфологические проявления СД 2 типа, выраженность которых зависит от дозы используемых клеток и стадии их применения.

Показано, что 1 стадия развития СД 2 типа является предпочтительной для применения клеток костного мозга, т.к. при этом имеет место максимально выраженный эффект коррекции клинических, биохимических и морфологических нарушений в организме животных с СД 2 типа. Предпочтительно также применять клетки костного мозга либо на 1-ой стадии СД 2 (на 3-4 неделе стабильной гликемии) однократно в максимально высокой дозе (ЮОмлн.) и/или многократно (до 7 раз, в суммарной дозе до 27,5 млн. клеток).

Показано, что и на 2 стадии развития СД 2 типа введение клеток костного мозга является целесообразным, т.к. ослабляет темпы развития необратимых нарушений в органах и пролонгирует сроки жизни животных.

Обнаружение трансплантируемых клеток костного мозга, содержащих ген GFP, в тканях реципиента (C57BL/KsJYLeprdb/+) в течение длительного времени (до 120 суток) позволяет предложить метод трансплантации клеток мышей линии B10.GFP для контролирования процессов восстановительного морфогенеза у животных с СД 2 типа.

  1. Предложенная генетическая модель сахарного диабета мышей линии C57BL/KsJYLeprdb/+ является адекватной моделью СД 2 типа, так как она воспроизводит стадии нарушения углеводного обмена, развитие дисфункции островков Лангерганса в поджелудочной железе, а также патоморфологические нарушения во внутренних органах, клинический, биохимический и морфологический контроль которых может быть использован для поиска и оценки новых эффективных способов лечения этого заболевания, в том числе трансплантации клеток костного мозга.

  2. Эффективность трансплантации стволовых и прогениторных клеток костного мозга при СД 2 типа зависит от стадии клинических проявлений заболевания (тяжести заболевания), количества используемых клеток и степени их биорегуляторной активности. Наиболее выраженньш клинический эффект наступает при использовании высоких доз культивируемых клеток костного мозга от здоровых животных,

трансплантируемых или однократно (ЮОмлн. клеток), или дробно многократно (27,5 млн. клеток).

  1. На стадии выраженных клинических и патоморфологических нарушений внутренних органов трансплантация клеток костного мозга не нормализует показатели углеводного обмена, но способствует замедлению темпов развития необратимого повреждения в органах и увеличивает сроки жизни животных с СД 2 типа (до 447 дней вместо 199 дней в контроле - СД 2 типа).

  2. Введение клеток костного мозга на ранней стадии развития СД 2 типа длительно нормализует показатели углеводного обмена и стабилизирует массу тела за счет индукции процессов адаптации и их восстановительной регенерации (гипертрофия, гиперплазия) в островках Лангерганса, что отодвигает развитие необратимых повреждений внутренних органов и существенно увеличивает сроки жизни животных (до 537±17,1 дней вместо 199 дней в контроле).

  3. Клетки костного мозга после трансплантации сохраняются в организме реципиента в течение длительного времени (до 120 дней) и индуцируют процессы восстановительного морфогенеза внутренних органов.

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены на:

  1. Научной конференции «Биомоделирование и биомедицина» Москва-Столбовая, 25 мая 2006г.

  2. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 24-25 мая 2006г.

  3. Научно-практической конференции «Проблемы клинической фармакологии и моделирования в фармакологии и биомедицине» Ростов - на -Дону, 19-20 сентября 2006г.

  4. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 30-31 мая 2007г.

  5. Ежегодной всероссийской конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» Москва, 29 мая 2008г.

  6. IV Всероссийском съезде трасплантологов, посвященный памяти акад. В.И. Шумакова, Москва, 9-Ю ноября 2008г.

Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехногий 13 марта 2009г.

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 в центральном рецензируемом журнале.

Диссертация содержит 6 глав и состоит из введения, обзора литературы (I глава), общей характеристики проведенных лабораторных и клинических исследований (II глава), 3 глав собственных результатов (главы III, IV, V) с обсуждением их (глава VI), а также выводов, практических рекомендаций, и списка использованной литературы. Диссертация имеет библиографический указатель, который содержит 260 источников, включающих в себя 96 отечественных и 164 зарубежных источников. Работа изложена на 184 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 39 рисунков.


© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net