Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Медицинские науки
Фармакология

Диссертационная работа:

Антонов Иван Михайлович. Эффективность и безопасность применения непрямого антикоагулянта варфарина при его дозировании, основанном на результатах фармакогенетического тестирования : диссертация ... кандидата медицинских наук : 14.00.25 / Антонов Иван Михайлович; [Место защиты: ГОУВПО "Московская медицинская академия"].- Москва, 2009.- 88 с.: ил.

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

ОГЛАВЛЕНИЕ 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

  1. Место оральных антикоагулянтов непрямого действия в кардиологической практике 10

  2. Традиционный подход к дозированию оральных антикоагулянтов непрямого действия 11

  3. Проблемы при применении оральных антикоагулянтов непрямого действия 13

  4. Генетические факторы, влияющие на терапию оральными антикоагулянтами непрямого действия 14

  5. Алгоритмы дозирования варфарина, учитывающие результаты фармакогенетического тестирования 23

  6. Преимущества фармакогенетического подхода к дозированию варфарина перед традиционным 39

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42

  1. Реактивы и ферменты 42

  2. Расходные материалы 44

  3. Буферные растворы 45

  4. Дизайн исследования 46

  1. Определение показателя MHO 47

  2. Выделение геномной ДНК 47

  3. Подбор праймеров для ПНР 48

  4. Амплификация ДНК 48

  5. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами.... 50

  6. Электрофоретическое разделение ДНК 50

  7. Статистическая обработка результатов 51

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 52

  1. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование 52

  2. Выбор алгоритма дозирования варфарина с учетом результатов фармакогенетического тестирования для его последующего использования в проспективном исследовании 60

  3. Сопоставление частоты развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции при применении варфарина с помощью фармакогенетического и традиционного подходов 66

  4. Сопоставление частоты развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции между группой с использованием фармакогенетического подхода к дозированию варфарина и группой традиционного подхода для пациентов с «функционально-дефектными» аллелями генов СУР2С9и VKORC1 67

  5. Сопоставление частоты развития кровотечений при применении варфарина с помощью фармакогенетического и традиционного подходов 71

3.6. Сопоставление частоты развития кровотечений между
группой с использованием фармакогенетического
подхода к дозированию варфарина и группой
традиционного подхода для пациентов с
«функционально-дефектными» аллелями генов CYP2C9 и
VKORC1 72

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 75

ВЫВОДЫ 83

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 84

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 85

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

VKORC1 витамин К-эпоксид редуктаза (соответствующий ген

обозначен курсивом)

CYP2C9 цитохром Р450 2С9 (соответствующий ген обозначен

курсивом)

АКНД антикоагулянты непрямого действия

ДВ Доза варфарина

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛС лекарственное средство

МИЧ международный индекс чувствительности

MHO международное нормализованное отношение, показатель,

характеризующий свертываемость крови, чем он выше, тем свертываемость ниже

ПВ протромбиновое время

п.н. пара нуклеотидов - мера длины фрагмента двунитевой ДНК

ПО протромбиновое отношение

ППТ Площадь поверхности тела (формулу вычисления см. в

тексте) <

ПНР полимеразная цепная реакция

ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

РСТ референтный стандарт тромбопластина

ТП трепетание предсердий

ТЭО тромбоэмболические осложнения

ФП фибрилляция предсердий

Введение к работе:

Тромботические осложнения являются одной из главных причин смертности и инвалидизации, приносящих огромный экономический ущерб государству. Наблюдается рост числа больных с высоким риском этих осложнений. Применение лекарственных средств (ЛС) из группы оральных антикоагулянтов непрямого действия (АКНД) является единственным и безальтернативным методом длительной амбулаторной профилактики тромбозов — доказана их эффективность при первичной и вторичной профилактике тромбоэмболических осложнений у больных с мерцательной аритмией и, прежде всего, ишемического инсульта [Framingham, 2003]. Терапия АКНД снижает риск всех инсультов в среднем на 62%. Доказано преимущество терапии АКНД с точки зрения профилактики первичных и повторных тромбоэмболии [Ederhy, 2004].

Терапия АКНД крайне важна пациентам с протезами клапанов сердца, высокий риск тромбоэмболических осложнений у которых резко возрастает при фибрилляции предсердий. Показано, что снижение риска тромбоэмболических осложнений при терапии АКНД составляет 75%. [Cannegieter, 2004]. При этом обнаружено, что потребность в терапии АКНД увеличивается с возрастом, также как и риск возникновения тромбозов.

Подбор индивидуальной дозы АКНД и дальнейшее поддержание необходимого уровня коагуляции достигается при помощи лабораторного контроля терапии. В настоящее время утвердился метод контроля показателя международного нормализованного отношения (MHO) [Kirkwood, 1983]. Этот метод основан на доказанной взаимосвязи показателя MHO с эпизодами гипокоагуляции у лиц, принимающих АКНД.

Несмотря на всю точность лабораторного контроля и наличие схем тщательного подбора дозы, главной опасностью при назначении АКНД остается возможность развития кровотечений. Геморрагии возникают с

частотой до 26%, из них «большие» (т.е. приводящие к смерти, госпитализации или ее продлению) в т.ч. фатальные - до 4,2% [Fihn, 1993]. Из 700 тыс. пациентов с мерцательной аритмией, получающих варфарин ежедневно, у 17 тыс. развиваются кровотечения, которые в 4 тыс. случаев приводят к летальному исходу [Lipton, 2003]. Риск развития кровотечений напрямую зависит от уровня MHO и возрастает в 1,37 раза с каждыми 0,5 единицы его повышения [Goiter, 1999]. При этом бессимптомное повышение MHO может происходить не только на этапе насыщения АКНД, но и при длительном применении [Панченко Е.П., 2001]. Поэтому актуальным представляется изучение факторов, определяющих индивидуальную чувствительность к АКНД. Одним из таких факторов являются генетические особенности пациента.

Большинство АКНД метаболизируются изоферментами цитохрома Р-450 CYP2C9. Для данного белка известны альтернативные изоформы CYP2C9*2 и CYP2C9*3), характеризующиеся значительным снижением активности [Yin, 2006]. Другим важным генетическим фактором, обуславливающим изменение индивидуального ответа пациента на терапию АКНД, является генетический полиморфизм 1-й субъединицы витамин К эпоксидредуктазы (VKORC1) - молекулы-мишени всех АКНД.

Предполагается, что использование персонализованного подхода, основанного на результатах фармакогенетического тестирования, к дозированию АКНД может способствовать снижению риска геморрагических осложнений [Schwarz, 2006]. Очевидно, что внедрение подобного подхода позволит более широко применять АКНД у нуждающихся в них пациентов, за счет повышения безопасности лечения данными препаратами. При всей важности вопроса, его практическая реализация не возможна без получения результатов проспективных исследований, подтверждающих преимущества фармакогенетического подхода к подбору индивидуальной дозы варфарина перед традиционным, которые не проводились ранее у российских пациентов.

Цель исследования: оценка преимуществ фармакогенетического подхода к дозированию АКНД варфарина по сравнению с традиционным методом с целью повышения эффективности и безопасности его применения у больных с высоким риском тромбоэмболических осложнений.

Задачи исследования:

1. На основании результатов ретроспективного исследования выбрать
оптимальный для российских пациентов алгоритм дозирования варфарина,
основанный на результатах фармакогенетического тестирования.

  1. Сопоставить частоты развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции при использовании фармакогенетического алгоритма дозирования варфарина и традиционного метода подбора дозы у пациентов с высоким риском тромбоэмболических осложнений.

  2. Сопоставить частоты кровотечений при использовании фармакогенетического алгоритма дозирования варфарина и традиционного метода подбора дозы у больных с высоким риском тромбоэмболических осложнений.

4. Выявить предпосылки для совершенствования
фармакогенетического алгоритма дозирования варфарина у российских
пациентов с высоким риском тромбоэмболических осложнений.

Научная новизна. Впервые проведен анализ известных фармакогенетических подходов к расчету начальной дозы варфарина, применительно к российским пациентам, на основании которого был выбран оптимальный алгоритм. Впервые фармакогенетический алгоритм дозирования варфарина применен в отечественной клинической практике в условиях многопрофильного стационара, при этом показаны его преимущества в плане поддержания более стабильного уровня гипокоагуляции и снижения частоты кровотечений. Впервые

проанализированы ассоциации генетического полиморфизма CYP2C9 и VKORC1 с величиной поддерживающей дозы и частотой развития чрезмерной гипокоагуляции, что является предпосылкой к совершенствованию фармакогенетического алгоритма дозирования варфарина.

Практическая значимость работы. Разработаны клинические рекомендации по дозированию варфарина, учитывающего также тендерные, антропометрические характеристики, данные анамнеза, сопутствующие заболевания и возможные взаимодействия варфарина с другими ЛС. Продемонстрированные преимущества дозирования варфарина на основе фармакогенетического тестирования создали предпосылки для внедрения данного подхода в систему здравоохранения России.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Место оральных антикоагулянтов непрямого действия в кардиологической практике

Производные индоандиона (фениндион) и кумарина (варфарин, неодикумарин, аценокумарол) образуют группу препаратов - оральных антикоагулянтов непрямого действия или антагонистов витамина К. В настоящее время АКНД, занимают лидирующие позиции в качестве препаратов выбора для профилактики тромбоэмболических осложнений сердечно-сосудистых заболеваний. Данные ЛС обладают «хорошей» доказательной базой, обуславливающей их широкое применение в лечении и профилактике заболеваний сердечно-сосудистой системы. В частности, доказанной является эффективность АКНД для первичной и вторичной профилактики тромбоэмболических осложнений у больных с мерцательной аритмией и непосредственно ишемического инсульта, как наиболее частого из них (91% всех случаев - Framingham, Shibata, Whitehall). Анализ объединенной базы исследований по антитромботической терапии в сравнении с плацебо показал, что терапия АКНД, и, в частности, варфарином, снижает риск всех инсультов более эффективно (на 62%), по сравнению с ацетилсалициловой кислотой (22%) [Ederhy, Cohen, 2006]. Исследование ACTIVE-W (Atrial Fibrillation Clopidogrel Trial with Irbesartan for Prevention of Vascular Events) доказало преимущества терапии АКНД с точки зрения профилактики первичных и повторных тромбоэмболии перед антиагрегантами (клопидогрел) в сочетании с ацетилсалициловой кислотой.

Доказано так же, что терапия АКНД остается крайне важным и обязательным показанием у лиц, с протезированными клапанами сердца, высокий риск тромбоэмболических осложнений у которых и, так резко возрастает при возникновении у них фибрилляции предсердий. Мета-анализ Cannegieter (1994), включивший в себя более 13000 больных с

искусственными клапанами сердца, показал, что снижение риска тромбоэмболических осложнений при терапии АКНД составляет 75%. [Дземешкевич С.Л, Панченко Е.П., 2001].

Таблица 1.1.1.

Проведенные исследования варфарина, применяемого для профилактики ишемического инсульта [Панченко Б.П., 2002]

Применение АКНД остается актуальным в случаях любой профилактики и лечения тромбофлебитов, венозных и артериальных тромбозов и эмболии.

В 2003 году национальный институт здоровья США досрочно закончил широкомасштабное, мультицентровое исследование (PREVENT), в котором была доказана эффективность низких доз варфарина, в плане профилактики венозных тромбоэмболии. Допускается так же применение АКНД и при инфаркте миокарда, и в послеоперационном периоде - при наличии противопоказаний к применению гепарина.

1.2. Традиционный подход к дозированию оральных антикоагулянтов непрямого действия

Крайняя непредсказуемость эффекта АКНД при фиксированном дозировании определяет необходимость коагулогического контроля при их применении. Существуют разные методики такого контроля, одним из них является «тромбопластиновый тест Квика (1937)», в соответствии с

рекомендациями ВОЗ (1981,1999). Главным недостатком этого метода считается необходимость построения калибровочной кривой, в сравнении ее с нормой, проведение требует использования высокостандартизированной нормальной контрольной плазмы.

Таблица 1.2.1.

Традиционный алгоритм подбора дозы варфарина [Инструкция по медицинскому применению варфарина]

* насыщающая доза может быть уменьшена, если возраст больного превышает 70 лет, содержание белка в сыворотке крови менее 60 г/л или масса тела больного менее 60 кг.

** Для больных после операции имплантации искусственных клапанов сердца целевой диапазон MHO 2,5-3,5, при этом используется аналогичный алгоритм насыщения.

К настоящему моменту во всем мире для коагулогического контроля при использовании АКНД применяется метод мониторирования MHO (международного нормализованного отношения [Kirkwood, 1983]). Основным критерием его корректности можно считать применение значения

МИЧ (международный индекс чувствительности используемого тромбопластина от 0,7 до 1,1). Разработаны экспресс методики определения MHO при заборе небольшого количества капиллярной крови. Многочисленные клинические исследования позволили установить баланс между эффективной терапией и риском развития осложнений. Он выражен в трех диапазонах значения MHO - от 2,0 до 3,0 (для всех больных, в том числе и с фибрилляцией предсердий), от 2,5 до 3,5 (для больных с протезами сердечного клапана и/или с мерцательной аритмией), и в некоторых случаях -от 1,8 до 2,0 (если больной старше 70 лет). Дозировка препаратов, используемая для достижения этих уровней MHO, значительно варьирует у разных лиц, во многом это связано с множественными индивидуальными параметрами пациента, такими как возраст, пол, телосложение, сопутствующие заболевания, рацион питания, получаемая терапия, генетическая вариация метаболизма и пр. Существует разработанная клинически схема подбора дозы АКНД (таблица 1.2.1).

1.3. Проблемы при применении оральных антикоагулянтов непрямого действия

В исследовании, проведенном в Институте клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова на двух группах пациентов (по 70 человек в каждой), принимающих варфарин и аценокумарол, было обнаружено бессимптомное повышение MHO, зарегистрированное на разных этапах терапии, в 11,4% и 48,6% соответственно [Панченко Е.П. с соавт., 2007]. Во многих работах можно проследить наличие значимого процента кровотечений, возникающих в диапазоне MHO от 2,0 до 3,0 - это соответствует самому распространенному терапевтическому диапазону. По данным этих же авторов, при применении двух АКНД - аценокумарола и варфарина развитие геморрагических осложнений отмечалось как при повышении MHO, так и при терапевтических значениях показателя (частота всех геморрагии составила 25 и 20% в год для аценокумарола и варфарина соответственно).

Частота развития геморрагических осложнений при терапевтических значениях MHO в обеих группах достоверно не различалась. В этих наблюдениях обращали на себя внимания больные с рецидивирующими кровотечениями, происходящими в период до трех лет терапии аценокумаролом на фоне MHO, находящегося в пределах терапевтического диапазона (от 2,0 до 3,0).

Из вышесказанного можно заключить, что, несмотря на все предпринимаемые меры, риск развития кровотечений на фоне терапии АКНД продолжает оставаться высоким. Поэтому изучение индивидуальной чувствительности больного к ЛС данной группы остается актуальным. Наряду с приведенными выше факторами, большой практический интерес может представлять продолжение изучения индивидуальной чувствительности пациентов к терапии АКНД с точки зрения генетического полиморфизма.

1.4. Генетические факторы, влияющие на терапию оральными антикоагулянтами непрямого действия

Применяемые в настоящее время в клинической практике АКНД (варфарин, аценокумарол и фенпрокумон) производятся в виде рацемических смесей S- и R-энантиомеров. Эти энантиомеры метаболизируются различными изоферментами цитохрома Р-450 и существенно различаются по антикоагулянтной активности (S-варфарин в 5 раз превышает антикоагулянтную активность R-варфарина) [Yin, Miyata, 2006]. Известно, что основным ферментом биотрансформации АКНД является изофермент цитохрома Р-450 CYP2C9, который осуществляет процесс гидроксилирования S-энантиомеров всех трех вышеупомянутых кумаринопроизводных, а так же R-аценокумарола и, в меньшей степени, R-фенпрокумона. В свою очередь, R-варфарин гидроксилируется с образованием неактивных метаболитов при участии изоферментов CYP1A1,

CYP2C19, CYP1A2. R-фенпрокумон метаболизируется CYP3A4. Антикоагулянтный эффект варфарина и фенпрокумона обусловлен преимущественно фармакологическим действием его S-энантиомеров. Антикоагулянтные эффекты S и R-аценокумарола сопоставимы. Тем не менее, несмотря на различия в биотрансформации S- и R-энантиомеров, общепризнанным является тот факт, что именно активность CYP2C9 в основном и определяет скорость биотрансформации АКНД, особенно варфарина. Как следствие, изменение активности CYP2C9 под действием различных факторов может приводить к клинически значимым изменениям концентрации варфарина в плазме крови [Loebstein, 2005].

На рисунке 1.4.1. приводится упрощенная схема метаболизма наиболее широко применяемого АКНД - варфарина и влияние его на процесс превращения факторов свертывания крови в печени. На схеме «жирной» стрелкой изображен более высокий уровень ингибирования витамин К-эпоксид редуктазы S-варфарином (обеспечивает до 70% общего антикоагулянтного эффекта), по сравнению с R-варфарином. В результате образуются неактивные метаболиты, главным из которых является S-7-гидроксиварфарин. Следует отметить, что наравне с К-эпоксид-редуктазой, мишенью для АКНД так же является и редуктаза хинона витамина К, которая участвует в восстановлении хинона витамина К до гидрохинона витамина К. Последнее соединение требуется в процессе витамин К зависимого карбоксилирования, наряду с наличием молекулярного кислорода и диоксида углерода. Такая схема, в той или иной степени, справедлива для всех АКНД, содержащих 4-гидроксикумарин [Макацерия А.Д., 2003].

Таким образом, на сегодняшний день фармакогенетические подходы к терапии АКНД могут развиваться по большому количеству направлений. Главным фактором, необходимым для персонализации применения АКНД, является идентификация «функционально-дефектных» аллельных вариантов гена CYP2C9.

R-ВАРФАРИН

S-ВАРФАРИН

CYP3A4

CYP1A1 CYP1A2

CYP2C8 7-гидроксиварфарин 6-гидроксиварфарин

R-варфарин | S-варфарин |

6-ГИДрОКСІІД

8-гіідіхжсіід ІО-гццрокснд

Вит амин К

Восстановленный витамин К

Эпоксид витамина К

Предшенственниш II, VII, IX, X факторов свертывания крови + протеины С и S

Активированные II, VII, IX, X факторы свертывания крови + протеины С и S

Гидрохинон витамина К

Са++

связывание витамин К-зафисимых факторов с фосфолипидами

Рисунок 1.4.1. Метаболизм и антикоагулянтное действие варфарина.

Ген CYP2C9 локализован на 10 хромосоме (локус 10q24), его длина составляет 55 000 пар оснований (п.о.). На сегодняшний день для данного гена выявлено более 20 аллельных вариантов (таблица 1.4.1). Самым распространенным аллельным вариантом является CYP2C9*! (аллель «дикого типа»). У лиц, в генотипе которых присутствуют только аллели «дикого типа», биотрансформация кумаринов проходит с нормальной интенсивностью, и среднетерапевтические дозы и уровни MHO являются для таких людей наиболее приемлемыми. Изучение аллельных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3, как наиболее часто встречающихся после аллеля

«дикого типа», показали, что они ассоциируется с более высокими концентрациями S-варфарина в плазме крови, а так же с более низкими значениям его клиренса, из-за замедления биотрансформации. Более того, показано, что риск развития кровотечений у пациентов, в генотипе которых присутствуют аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3, возрастает в 2-3 раза. Также у них в 3-4 раза чаще развиваются эпизоды чрезмерной гипокоагуляции, когда MHO возрастает до уровня выше 3,0 [Сычев Д.А. с соавт., 2007]. Системный мета-анализ показал, что пациенты с «функционально-дефектными» аллелями гена CYP2C9 требуют более длительной процедуры титрования дозы АКНД до подобранной. Также они могут демонстрировать внезапное чрезмерное повышение уровня MHO, как в период титрования дозы АКНД, так и при длительной терапии [Taubeetal., 2000].

Несмотря на большое количество аллельных вариантов гена CYP2C9, обнаруженных к настоящему времени (что свидетельствует о высоком исследовательском интересе к данному вопросу) и представленных в таблице 1.4.1, большая их часть изучена недостаточно. Аллель CYP2C9*4 обнаружен только у монголоидов, причем частота его мала. Варианты CYP2C9*5 и CYP2C9*6 встречаются с частотой не более 1% у негроидов и практически отсутствуют у монголоидов и европеоидов. Самыми распространенными и хорошо изученными вариациями, в плане влияния на лекарственный ответ при применении варфарина, являются аллели CYP2C9*!, CYP2C9*2 и CYP2C9*3 [Herman et al., 2005].

Аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3 различаются по скорости биотрансформации соответствующих ЛС. Так у гомозигот CYP2C9*2/*2 и CYP2C9*3/*3 биотрансформация варфарина снижена в большей степени, чем у гетерозигот CYP2C9*l/*2 и CYP2C9*l/*3. Самая низкая биотрансформационная активность наблюдается у гомозигот CYP2C9*3/*3, она составляет, по мнению некоторых авторов, около 5% от нормы.

Таблица 1.4.1.

Некоторые аллельные варианты гена CYP2C9 и их эффекты [Yin, Miyata, 2007]

Имеющиеся данные об ассоциации полиморфизма гена CYP2C9 с изменением лекарственного ответа на варфарин уже применяются многими авторами для оценки риска развития кровотечений.

Таблица 1.4.2.

Факторы риска развития кровотечений при терапии варфарином [Gage et al.,

2006]

На основе анализа 3791 историй болезни малоимущих пожилых пациентов, с фибрилляцией предсердий, предложена шкала для расчета риска развития кровотечений при применении варфарина (табл. 1.4.2) [Gage et al., 2006].Частота развития геморрагических осложнений при применении варфарина у больных с постоянной формой мерцательной аритмии, в зависимости от суммы баллов по шкале HEMORR2HAGES, представлена в таблице 1.4.3.

Таблица 1.4.3.

Риск развития кровотечений при терапии варфарином по шкале HEMORR2HAGES [Gage et al., 2006]

Другим значимым генетическим фактором, важным для индивидуализации фармакотерапии АКНД, и, в частности варфарином, является полиморфизм гена VKORC1, кодирующего образование субъединицы 1 белкового комплекса витамин К эпоксидредуктазы [Rost et al., 2004]. Данный ген располагается в 16 хромосоме (локус 16р11.2), его длина составляет 4 000 п.о. Полиморфизм именно этого гена связывают с

кумаринорезистентностью [Shwartz, Stein, 2006] и образованием так называемого «фенотипа кровотечений», возникающего из-за врожденного дефицита витамин К зависимых факторов свертывания крови [Gage, Eby, 2003]. Принимая во внимание механизм действия АКНД, становится ясным, почему у пациентов с «функционально-дефектными» аллелями гена VKORC1 эффект от терапии варфарином по стандартной схеме дозирования может значительно различаться. Наиболее часто встречаемые однонуклеотидные замены в гене VKORC1, выявленные к настоящему моменту, в количестве 10 штук, комбинируют в 5 основных гаплотипов. Из этих гаплотипов, в свою очередь, были сформированы группы А (гаплотипы HI и Н2) и В (гаплотипы Н7, Н8, Н9). В группу А входят пациенты с предрасположенностью к низким дозам варфарина, в группу В - пациенты, которым требуется большая доза данного ЛС [Rieder et al., 2005].

Таблица 1.4.4. Генотипы VKORC1, дополнительные полиморфизмы и их эффект

*доза варфарина более 70 мг в неделю

Проанализированные материалы позволяют составить следующую таблицу, в которой отображена связь ответа системы VKOR на терапию варфарином, в зависимости от генотипа VKORC1 по основным гаплотипам и дополнительным полиморфизмам.

В работе ведущих американских специалистов в области фармакогенетики АКНД на основе изучения генотипов VKORC1 по основным гаплотипам в группе из 553 пациентов были предложены режимы дозирования варфарина, в зависимости от того, какие гаплотипы данного локуса представлены у пациента [Rieder et al., 2005]. Диапазоны получились следующими: от 2,7 до 3,4 мг/день - для гаплогенотипа АА, от 4,3 до 4,9 мг/день - для гаплогенотипа АВ и от 6 до 6,2 мг/день - для гаплогенотипа ВВ. Причем данные дозировки подвергаются модификации, в зависимости от того, выявляются ли у пациента «функционально-дефектные» аллели гена CYP2C9 или нет (рисунок 1.4.2).

АА АВ ВВ

Все пациенты

АА АВ ВВ

Носители "дикого" аллеля (CYP2C91*!)

АА АВ ВВ

Носители аллельных вариаций CYP2C9

Рисунок 1.4.2. Взаимосвязь доз варфарина с гаплогенотипом по локусу VKORC1 и генотипом по локусу CYP2C9 [Rieder et al., 2005].

Постоянно продолжается поиск дополнительных генетических факторов, учет которых может способствовать повышению эффективности и безопасности терапии АКНД. Среди наиболее вероятных генов-кандидатов

необходимо упомянуть гены, кодирующие: гамма-глутамат карбоксилазу (GGCX), участвующую в посттрансляционном процессинге гепатоцитов, геммикросомальную эпоксидгидроксилазу (ЕРНХ) и гликопротеин Р (MDR1) [Wadelius et al., 2005; D'Andrea et al., 2005; Vecsler et al., 2006]. Полиморфизм гена APOE, кодирующий аполипопротеин E, так же может иметь большое значение для более точного подбора дозы АКНД. Отмечено, что у пациентов, в генотипе которых присутствует аллель АРОЕ*Е4, наблюдается более интенсивный захват гепатоцитами витамина К, поэтому не удивительно, что таким пациентам требовалась большая доза АКНД и, в частности, варфарина для достижения терапевтического уровня антикоагуляции [Kohnke Н et al., 2005].

Тем не менее, анализ большого количества публикаций позволяет предположить, что главными генетическими факторами, обуславливающими индивидуальную чувствительность пациентов к терапии варфарином, являются генетические полиморфизмы CYP2C9 и VKORC1 [Vecsler et al., 2006].

1.5. Алгоритмы дозирования варфарина, учитывающие результаты фармакогенетического тестирования

К настоящему времени подсчитано, что за все время с момента начала разработки фармакогенетических тестов было выпущено более 21 тысячи различного рода рекомендаций, касательно персонализации фармакотерапии с их помощью [Flockhart, 2009].

При традиционном подходе к применению АКНД начальная доза, например, варфарина составляет 5 мг/сутки. Далее регулярно измеряется показатель MHO, в течение последующих 4-5 дней дозировка существенно не изменяется и остается на данном уровне. Показано, что в период «насыщения» варфарином у пациентов с различными аллелями гена CYP2C9, в том числе и с «функционально-дефектными», не наблюдается серьезных

различий в дозировании (первые 5 дней терапии) [Peyvandi, 2004]. Таким образом, применение фармакогенетических тестов в клинике можно рекомендовать именно в этот промежуток времени.

На основании результатов многочисленных исследований по фармакокинетике S-варфарина, были получены графики, отражающие зависимость концентрации S-варфарина от времени подбора индивидуальной дозы данного АКНД у больных с различными генотипами по локусу CYP2C9 при различных алгоритмах дозирования (рисунок 1.5.1) [binder et al., 2002]. Эти графики ярко демонстрируют преимущество метода, совмещающего общепринятый вариант дозирования (график 3 на рисунке 1.5.1) АКНД на этапе насыщения, с коррекцией дозы на основании результатов фармакогенетического тестирования.

В качестве основного инструмента коррекции дозы авторы предлагают пропускать прием препарата до 5 дней, что составляет приблизительно 5 периодов полувыведения варфарина. Это предполагается делать в том случае, если предполагаемая доза варфарина, рассчитанная по фармакогенетическому алгоритму, для данного пациента составляет менее 5 мг/день, а MHO на этапе насыщения уже приблизилось к должному (терапевтическому) уровню. После такого перерыва, рекомендуется продолжить терапию с дозы, модифицированной на основании результатов фармакогенетического тестирования (Таблица 1.5.1).

В тех случаях, когда рассчитанная доза варфарина превышает 5 мг/сутки, авторы предлагают проводить более «аккуратное» титрование дозы, в сторону ее увеличения, с последующим доведением до необходимого, под контролем показателя MHO.

Однако рассмотренная схема дозирования варфарина является не точной. Некоторые аспекты индивидуализации терапии в ней присутствуют, но они явно недостаточны для значительного повышения эффективности и безопасности применения данного ЛС. Вместе с тем, многие исследователи

работают над созданием более «динамичных» схем дозирования варфарина, представляющих из себя уравнения, в которые необходимо подставлять индивидуальные данные пациента, а «на выходе» получать рекомендуемую дозу. Рассмотрим подобные подходы подробнее.

Рисунок 1.5.1. Различные алгоритмы дозирования варфарина. График 1. Традиционный метод подбора индивидуальной дозы, начиная с 5 мг

[binder et al., 2002].

Рисунок 1.5.1. Различные алгоритмы дозирования варфарина. График 2. Подбор дозы на основании результатов фармакогенетического тестирования, начиная с дозы, рассчитанной по соответствующему алгоритму

[binder et al., 2002].

Рисунок 1.5.1. Различные алгоритмы дозирования варфарина. График 3. Традиционный метод подбора индивидуальной дозы, начиная с 5 мг, совмещенный с последующей коррекцией (в период до 5 дня) на основании результатов фармакогенетического тестирования [binder et al., 2002].

Таблица 1.5.1.

Модификация дозы варфарина при смешанном алгоритме дозирования на основании результатов фармакогенетического тестирования по локусу CYP2C9

Коллектив исследователей Sconce Е.А. et al. предложил следующую формулу, которая учитывает возраст пациента, генотип по локусу CYP2C9, генотип по локусу VKORC1, а также рост пациента.

Эта формула выглядит следующим образом:

Доза,мг/день=[0.628-0.0135хвозраст-0,24хСГР2С5?*2-0.37xCYP2C9*3-0.241xVKORCl+ 0.0162хрост (см)]2

где показатели CYP2C9 составляют «О», «1» или «2», в зависимости от того, сколько «функционально-дефектных» аллелей данного типа представлено в генотипе пациента, а показатель VKORC1, в зависимости от генотипа пациента по группам гаплотипов данного локуса (см. выше), составляет «1» для генотипа ВВ, «2» - для АВ, и «3» - для АА. Данная формула была успешно применена в группе из 297 английских пациентов, которым был назначен варфарин, с целевым MHO 2,0-3,0 [Sconce Е.А. et al., Blood]. Тем не менее, многие авторы скептически отнеслись к данной попытке применения фармакогенетического подхода к назначению варфарина. Во-первых, точность дозирования (совпадение расчетной дозы с реально подобранной) составляла, в среднем, 54%. Во-вторых, авторы не провели разделения пациентов на тех, кто принимал варфарин длительно, и на тех, кому данное ЛС было назначено недавно. Также все пациенты существенно различались по назначаемой сопутствующей терапии.

Другая попытка была предпринята коллективом Takahashi et al. На основании исследования, проведенного на смешанной группе, в которую входили представители всех трех рас, они разработали свое уравнение:

Доза, мг/день=6.6-0.035хвозраст+0.031хвес (кг)

Данный усредненный алгоритм предназначен для больных, у которых в генотипе отсутствуют «функционально-дефектные» аллели по локусу CYP2C9. В случае наличия аллеля CYP2C9*2 (независимо от того, является ли больной гомозиготой или гетерозиготой по данному аллелю) авторы предлагают уменьшать рассчитанную по данного алгоритму дозу на 1,3 мг.

Если же в генотипе пациента присутствует аллель CYP2C9*3, дозу предлагается уменьшать на 2,9 мг [Takahashi et al., 2006]. Очевидным недостатком данной работы является игнорирование этнических особенностей пациентов, т.е. отсутствие в уравнении аргумента, учитывающего расовую принадлежность пациента.

Американские исследователи [Hillman et al., 2005] разработали свою методику подбора дозы варфарина, на основе изучения 453 пациентов с различными патологиями. Клиническая группа для данного исследования была хорошо подобрана, в частности, были исключены патологии, влияющие на подбор доз: злокачественные опухоли, заболевания печени, почек, исключена длительная терапия барбитуратами. Параметры, применяемые при выработке алгоритма, включали в себя: генотип CYP2C9 (СР2С9*1/*1> CYP2C9*l/*2, CYP2C9*2/*2, CYP2C9*l/*3, CYP2C9*3/*3 и CYP2C9*2/*3), возраст, пол, наличие сахарного диабета и площадь поверхности тела ППТ, вычисленную по формуле:

ППТ=вес 425хрост 725х0.007184

Для пациентов с генотипом CYP2C9*1/*1 среднее значение дозы варфарина составляло 36.5-15.5 мг/неделю (приблизительно 5 мг/день), а для гомозигот CYP2C9*3/*3 - 5.5 мг/неделю (приблизительно 1 мг/день). В результате авторами были составлены графики и таблицы коэффициентов изменения доз, предложенные в качестве алгоритма дозирования варфарина.

Красными штрихами отмечены средние дозы АКНД (варфарина) для пациентов с протезами сердечных клапанов (101 пациент). Следует отметить, что целевые цифры MHO у таких пациентов находятся в диапазоне от 2,5 до 3,5.

В этом исследовании была выявлена взаимосвязь между возрастом больного и оптимальной дозой варфарина. У всех пациентов наблюдается достоверное снижение необходимой дозы варфарина с возрастом. Однако у

лиц с сахарным диабетом возраст-обусловленное падение дозы выражено значительно сильнее, чем у пациентов, не страдающих данным аутоиммунным заболеванием. Женщины оказались приблизительно на 5% чувствительнее к терапии варфарином, чем мужчины.

і' п

&

1/"1 *1/*2 "1/*3 *2/*2 *2/*3 "ЗГЗ

Рисунок 1.5.2. Дозировка варфарина, в зависимости от генотипа по локусу CYP2C9.

Однако ясно, что такая корреляция «возраст-доза» не может быть связана только с возрастными изменениями активности изоферментов цитохрома Р450, так как, с точки зрения фармакогенетики, не существует серьезных различий в дозировании, например, НПВС (диклофенак и целекоксиб) у разных возрастных групп [Brenner, 2003]. Ниже приведена таблица поправочных коэффициентов, предложенная Hillman et al. Данные коэффициенты подставляются в единую формулу, по аналогии с вышеприведенными. При умножении всех коэффициентов на соответствующие показатели (рост, вес, возраст, ППТ, и др.) полученные значения необходимо складывать, принимая во внимание знак перед

коэффициентом. Для уточнения доз варфарина, в зависимости от наличия сопутствующего сахарного диабета, авторы рекомендую использовать специальные номограммы (рисунок 1.5.3).

Таблица 1.5.2.

«Поправочные» коэффициенты дозирования варфарина, в зависимости от индивидуальных особенностей пациентов [Hillman et ah]

* Возрастной фактор считается актуальным дл пациентов старше 66 лет;

і I

і

Ввзраст (лет)

Рисунок 1.5.3. Влияние сахарного диабета на дозирование варфарина.

Другой вариант научно-подтвержденных рекомендаций по назначению фиксированных доз варфарина, в зависимости от результатов фармакогенетического тестирования был предложен коллективом Moridani et al. Разделив всех получающих терапию варфарином пациентов на три группы (с клапанными протезами, с фибрилляцией предсердий и с венозными тромбозами), авторы рассчитали средние рекомендованные дозы для пациентов разных расовых групп и разных патологий, во взаимосвязи с генотипом по локусу CYP2C9 [Moridani et al., 2006]. Результаты их обобщений представлены на рисунке 1.5.4.

МЛ1 *1/*2 *1/*3 *2/*2 *3/*3 *2/*3

Генотипы CYP2C9

*х/*х

Рисунок 1.5.4. Взаимосвязь генотипов по локусу CYP2C9 с дозой варфарина.

В графике (б), вместо X необходимо подставлять CYP2C9*2 или CYP2C9*3. Расчеты производились с помощью статистической системы анализа данных ANOVA (ANalysis Of VAriance between groups). Авторы не нашли значимых различий в дозировании между различными пациентами, гомозиготными или гетерозиготными по аллелю «дикого типа» (генотипы CYP2C9*1/*1 и CYP2C9*1/*X). И поэтому рекомендуют дозы 5,5 и 5 мг в день для гомозигот и гетерозигот соответственно. Для пациентов с любыми другими генотипами, кроме CYP2C9*3/*3 рекомендуется доза 4,5 мг/сутки, а для больных с генотипом CYP2C9*3/*3 - 2,5 мг/сутки [Moridani et al., 2006].

Другое исследование, проведенное коллективом Voora et al. также заслуживает пристального внимания, т.к. в них была подтверждена эффективность алгоритма дозирования варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования. Для подбора целевых фиксированных доз использовалась построенная ранее формула Gage et al.

Д03а МГ/СУТКИ =10(0-385--0083ХвозРаст+ 0.498хППТ-0.208хСУР2С9*2-0.350хСУР2С9*і-0.341хамиодароіі+0.378хцелевоеМНО-0.125хстатнн-0.113храса-0.075хпол)

В случаях, когда пациент принимает амиодарон или статин (флувастатин или симвастатин - авт.) в формуле в соответствующий коэффициент подставляется единица, если нет - 0. В том случае, когда пациент принадлежит к европеоидной расе, расовый коэффициент равен 1, в любом другом случае — 0. Если пациент женского пола, то «половой» аргумент равняется 1, если мужского - 0. Авторами отмечено, что применение данной формулы позволило значительно уменьшить время подбора дозы для пациентов, имевших в генотипе «функционально-дефектные» аллели по локусу CYP2C9 - оно стало сопоставим со временем подбора дозы для пациентов с генотипом CYP2C9*1/*1. Была так же продемонстрирована высокая предсказательная ценность вышеприведенной формулы. Так для пациентов, которые получали терапию варфарином в подобранной дозе 1,5 мг/сутки (пациенты, имевшие в генотипе аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3), по формуле была прогнозирована постоянная доза варфарина в 1,8 мг/сутки. Таким образом, среднее расхождение фактических доз и прогнозируемых на основании результатов генетических исследований составляло менее 1 мг/сутки.

Применение расчетных формул для предсказания среднесуточной дозы варфарина позволяют значительно снижать время подбора доз, особенно у пациентов, у которых в генотипе присутствуют «функционально-дефектные» аллельные варианты по локусу CYP2C9, которым иногда

требуется несколько недель для подбора дозы и стабилизации MHO при традиционном методе дозирования [Higashi et al., 2002].

-I

о .

s *>

: qdo . - „

"j n * imjcjui аллель

в а a CYP2C9*X

D "

cc 4 1 1-

GO tV SO 13 0

Предполагаемая доза, яг/день

Рисунок 1.5.6. Корреляция расчетных доз варфарина с фактически подобранными [Higashi et al., 2002].

На рисунке 1.5.6 показана корреляция фактических и предсказанных доз, полученная в данном исследовании. «Закрашенные» значки означают отсутствие чрезмерной гипокоагуляции (когда показатель MHO превышает 4,0). Пустые значки - пациенты, у которых наблюдались 1 и более случаев повышения MHO более 4. Случаи повышения MHO выше терапевтических значений объясняются авторами тем, что у лиц с различными «функционально-дефектными» аллелями по локусу CYP2C9 время полувыведения S-варфарина становится фактически «неизвестным». Можно так же отметить, что формула Gage et al. в модифицированном виде представлена на бесплатном интернет-сайте в виде компьютерной программы по дозированию варфарина, представляющей из себя on-line калькулятор.

Все наиболее удачные из применяемых в настоящее время формул, лежащих в основе алгоритмов дозирования варфарина, являются линейным выражением экспоненциальной функции.

Tham et al. в своей работе по созданию алгоритма дозирования варфарина наряду с физикальными данными так же использовали такой параметр, как учет полиморфизма гена VKORC1. Вся группа из 281 пациента, принимавшая участие в исследовании, была тщательно отобрана по целому ряду показателей. Исключались любые влияния сопутствующих заболеваний, рациона питания и сопутствующей фармакотерапии. Итак, полученная авторами формула выглядела следующим образом:

Доза варфарина, мг/сутки=10(0'8380005хвозраст+0003хвес-

0.189xCYP2C9*3-0.283xVKORCl'381CC-0.119xVKORCr381TC)

Авторы рассматривали в качестве фактора, ассоциированного с дозировкой варфарина, полиморфизм С381Т гена VKORC1. Если пациент имел генотип по этому локусу, включавший данный аллельный вариант в гомозиготном или гетерозиготном состоянии, в соответствующий аргумент подставлялась единица, если нет - 0. В исследовании изучались различные гаплотипические варианты по локусу VKORC1 (сгруппированные по генотипам): HI/HI, Hl/H*, Н7/Н7, Н7/Н* и др. Интересными в этом исследовании представляются рекомендованные фиксированные суточные дозы варфарина по вариациям VKORC1 (таблица 1.5.4).

Таблица 1.5.4. Гаплотипы VKORC1 и рекомендуемые суточные дозы варфарина

Данное исследование позволило добиться прогнозирования дозы варфарина с доверительным интервалом 95% (погрешность 5%) у 53% лиц, принимавших участие в исследовании, что является серьезным положительным результатом. Так же приведены ценные данные по индивидуальным характеристикам пациентов, вошедших в исследование (таблица 1.5.5).

Таблица 1.5.5. Особенности алгоритма Tham et al.

Следует отметить, что среди лиц, не попавших в доверительный интервал 95%, не было пациентов, в генотипе которых присутствовал аллельный вариант CYP2C9*2. Также в данной группе были редки пациенты с аллельным вариантом CYP2C9*3. Интересен так же тот факт, что наиболее частым в группе «непредсказуемых» и «предсказуемых» являлся Н1/Н1 гаплогенотип по локусу VKORC1. Возможно, такой результат обусловлен

частотой данных гаплотипов у монголоидов, но авторы полагают, что в основе данного явления лежат какие-то другие механизмы, которые еще предстоит изучать в дальнейшем.

Многими авторами отмечается важное значение массы тела и ППТ в алгоритмах дозирования варфарина, основанньгх на результатах фармакогенетических исследований. Хотя существуют данные, что каждые дополнительные 10 кг массы тела предполагают увеличение средней дозы варфарина на 1,07 мг, Sconce et al. в своих исследованиях пришли к выводу, что использование ППТ предпочтительнее для расчетов дозирования варфарина, нежели масса тела.

Таким образом, необходимыми элементами применения алгоритма дозирования варфарина могут являться результаты фармакогенетического тестирования по локусам VKORC1 и CYP2C9, позволяющие идентифицировать «функционально-дефектные» аллельные варианты VKORC1-1639A, CYP2C9*2 и CYP2C9*3. Далее предлагается применение одного из предложенных алгоритмов, например, алгоритм Sconce et al. подставив 0,1 или 2, в зависимости от количества соответствующих аллелей:

Доза,мг/сутки=0.628-0.0135хВозраст-0.240хСГР2С5?*2-0.370xCYP2C9*3-0.24xVKORC1(-1639)A+0M62xvoct

Пример:

Пациенту ростом 170 см, возраст которого 90 лет, с генотипом CYP2C9*l/*3; VK0RC1(-1639)A/A будет рекомендована суточная доза варфарина в 6 раз ниже, чем пациенту с генотипом CYP2C9*1/*1; VKORCl(-1639)GG с такими же антропометрическими параметрами - 1.16 мг/сутки и 7.39 мг/сутки, соответственно. Высокие показатели разброса (до 65%) делают все вышеперечисленные модели дозирования варфарина крайне актуальными.

В проведенном мета-анализе 9 различных исследований (Furuya et al., Ogg et al., Aithal et al., Taube et al., Margaglione et al., Loebstein et al.,Tabrizi et al., Scordo et al., Higashi et al.) была подсчитана средняя частота каждого генетического варианта CYP2C9, и графически показан средний процент снижения доз варфарина, в зависимости от генетических детерминант, обуславливающих различия в уровне биотрансформации кумаринов (рисунки 1.5.7, 1.5.8) [Emery et al., 2008].

Рисунок 1.5.7. Влияние присутствия в генотипе пациента «функционально-дефектного» аллели CYP2C9*2 на дозу варфарина.

В этом мета-анализе продемонстрировано среднее снижение уровня биотрансформации варфарина на 81% среди пациентов, имевших в генотипе «функционально-дефектный» аллельный вариант CYP2C9*3. Высокая частота данного аллельного варианта (до 20% в различных европеоидных популяциях), делает проблему персонализации терапии варфарином на основе результатов фармакогенетического тестирования еще более актуальной.

Aithel

Taube

Margadiozie

Leobstein

Tabrizi

Scordo

Tagashi

Средний процент снижения 37 Л>

Доверительный интервал 95%

Различия к среднее уточных дозах

Рисунок 1.5.8. Влияние присутствия в генотипе пациента «функционально-дефектного» аллели CYP2C9*3 на дозу варфарина.

Во всех перечисленных исследованиях, авторы предлагают большое количество алгоритмов дозирования варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования, однако в каждом конкретном случае приводятся средние дозы варфарина, в зависимости от наличия у пациентов тех или иных генотипов. Эти обобщенные данные представлены в таблице 1.5.6.

Таблица 1.5.6.

Рекомендуемая коррекция дозы варфарина, в зависимости от влияния различных генетических факторов

Примечания:

  1. Значения округлялись до десятых долей;

  2. Данные по генетическому полиморфизму VKORC1 не учитывали полиморфизма CYP2C9, и наоборот

На основании этой обобщенной информации, в качестве примера приведем расчет дозы для одного пациента. Женщина, ростом 180 см, вес 75 кг, не курит, не принимает амиодарон или статины, генотип CYP2C9*2/*2; VKORCl(-1639)AA, ППТ равна 1,94 м2 (округляется до 2). По всем приведенным алгоритмам дозирования были получены следующие дозы: 4.5 мг/сутки (Tham et al.), 2 мг/сутки (Takahashi etal.), 1.5 мг/сутки (Hillman et al.), 1.675 мг/сутки (Sconse et al.) и 2,2 мг/сутки (Gage et al., . В итоге, доза варфарина, подобранная для данной пациентки, составила 2,3 мг/сутки.

Отечественные авторы также предприняли попытку создания индивидуализированного алгоритма дозирования варфарина на основании результатов фармакогенетического исследования. Сыркин А.Л. и соавт. предлагают свою регрессионную модель, учитывающую генотип CYP2C9 и наличие приема амиодарона. Алгоритм выглядит следующим образом:

Доза варфарина, мг/сутки=0,462+0,947х(Доза-генотип)-

0,855 хамиодарон

Где параметр «доза-генотип» имеет следующие значения: 4,92 при генотипе CYP2C9*!/*!, 3,68 при генотипе CYP2C9*l/*2, 3,58 при генотипе CYP2C9*l/*3. Для генотипов CYP2C9*2/*3 данный коэффициент принимается равным 3,13. В случае приема больным амиодарона следует подставить 1 в соответствующий аргумент, а в случае отсутствия амиодарона в терапии - 0.

1.6. Преимущества фармакогенетического подхода к дозированию варфарина перед традиционным

В настоящее время снижение риска медикаментозных осложнений при использовании фармакогенетического персонализованного подхода к

дозированию варфарина является четко доказанным фактом. Опыт некоторых развитых стран показывает так же экономическую эффективность существования специализированных клиник и медицинских служб, отслеживающих и корректирующих антикоагулянтную терапию больных с соответствующими к ней показаниями. Так Sullivan et al. в свой работе провели анализ экономической эффективности работы данных специализированных учреждений [Sullivan et al., 2006]. Выводом их работы, в которой была проведена оценка в масштабах одного штата США, было то, что снижение затрат на одного пациента по территории штата в среднем составило 2100 долл. США в год (по ценам 2004 года), по сравнению с ведением таких больных в обычных госпитальных и клинических учреждениях. Информация о таких исследованиях стимулировала в США дальнейшее развитие специализированных служб антикоагулянтной терапии (т.н. антикоагулянтные клиники). Это показывает экономическую эффективность любой персонализации лечения варфарином.

В настоящее время актуальными являются исследования, направленные на оценку экономической целесообразности дальнейшего развития персонализированного подхода к дозированию варфарина, в основу которого положены результаты фармакогенетического тестирования. You et al. провели фармакоэкономический анализ, в котором сопоставлялась экономическая эффективность фармакогенетического подхода к дозированию варфарина перед традиционным [You et al., 2009]. Стоимость терапии в группе, не генотипированной по CYP2C9 составила 155 700 долл. США против 150 500 долл. США. При этом маржинальная стоимость одного дополнительного предотвращенного большого кровотечения составляла 5778 долл. США. Авторы расценивают результат своего исследования как положительный.

В настоящее время, АКНД являются безальтернативными доступными ЛС, обладающими наибольшей доказанной эффективностью в профилактике тромботических осложнений. Поиск возможных альтернатив

АКНД продолжается в направлении создания ЛС из группы прямых ингибиторов тромбина. Большие надежды возлагались на прямой оральный ингибитор тромбина ксимелагатран. При проведении клинических исследований ксимелагатран показал положительные результаты, и он был выпущен на рынок в 2003 г., как средство для предотвращения венозной тромбоэмболии после ортопедической хирургии, для долгосрочной профилактики рецидивов венозной тромбоэмболии после стандартной терапии и для предотвращения инсультов на фоне постоянной формы мерцательной аритмии. Но FDA не одобрило ксимелагатран по целому ряду показаний. В основном, в связи с большим количеством случаев острых коронарных синдромов у принимающих этот препарат и возможностью печеночной недостаточности при долговременной терапии (повышение трансаминаз печени в 12% случаев) [Thompson, 2004]. В феврале 2006 г. компания Astra Zeneca изъяла препарат с рынка и прекратила его производство. В настоящее время единственным ЛС из этой группы, разрешенным к применению во многих странах, в т.ч. и в России, является аргатробан, однако его широкое применение огранивается высокой стоимостью.

В сложившихся обстоятельствах улучшение качества фармакотерапии АКНД становиться приоритетной задачей как с точки зрения повышения качества и продолжительности жизни пациентов, так и в экономическом аспекте.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и ферменты

В данной работе использовались следующие ферменты:

Taq-ДНК-полимераза, ЗАО «СибЭнзим», Россия, закуплена там

же;

протеиназа К из Tritirachium album, «Amresco», США, закуплена у ЗАО «Хеликон», Россия;

эндонуклеаза рестрикции 2 типа (далее «рестриктаза») Bmel8I, ЗАО «СибЭнзим», Россия, закуплена там же;

рестриктаза Mspl, ЗАО «СибЭнзим», Россия, закуплена там же;

рестриктаза Bse3DI, ЗАО «СибЭнзим», Россия, закуплена там же.

Химический синтез олигонуклеотидов, использованных в качестве праймеров для ПЦР, выполнен НПФ «Литех» и ЗАО «Синтол», Россия. В работе также были использованы следующие реактивы:

натрий додецилсульфат (SDS), биотехнологический уровень очистки 99,5%, «Amresco», США;

этидиум бромид, биотехнологический уровень очистки 98,5%, «Amresco» США

дезоксиаденозинтрифосфат тринатриевой соли тригидрат (dATP), 100 мМ водный раствор, «Fermentas», Литва;

дезоксицитозинтрифосфат динатриевой соли дигидрат (dCTP), 100 мМ водный раствор, «Fermentas», Литва;

дезокситимидинтрифосфат динатриевой соли дигидрат (dTTP), 100 мМ водный раствор, «Fermentas», Литва;

дезоксигуанозинтрифосфат динатриевой соли дигидрат (dGTP), 100 мМ водный раствор, «Fermentas», Литва;

агароза для электрофореза (Туре П), биотехнологический уровень очистки, «Amresco», США;

DL-дитиотреитол (DTT), биотехнологический уровень очистки 99,5%, «Amresco», США;

трис (гидроксиметил) аминометан, биотехнологический уровень очистки 99,8%, «Amresco», США;

масло минеральное (ОСЧ), «ICN», США;

этилендиаминтетраацетата динатриевая соль (ЭДТА) дигидрат, биотехнологический уровень очистки, 99,0 %, «Amresco», США;

акриламид, дважды очищенный кристаллизацией, стандартной очистки, 99,0%, «AppliChem», Германия;

г>Г,г>Г-метилен-бис-акриламид, биотехнологический уровень очистки 99,0 %, «Amresco», США;

ІЧ^І^ІЧ'-тетраметилзтилендиамин (TEMED),

биотехнологический уровень очистки 99,0%, «Lancaster», Великобритания;

гидроксид натрия (ОСЧ) 99,9%, «GERBU», Германия;

концентрированная соляная кислота (ХЧ), «Химмед», Россия;

фенол, сатурированный бидистиллированной водой и трис-буфером, рН=8,0, «Хеликон», Россия;

хлороформ (ХЧ), «Химмед», Россия;

спирт изоамиловый (ОСЧ) 98,5%, «Carl Roth GmbH & Co.», Германия;

спирт изопропиловый (ХЧ), «Химмед», Россия;

спирт этиловый медицинский, «Ферейн», Россия;

магний хлорид, гексагидрат (ОСЧ) >99,0%, «Amresco», США;

аммоний надсернокислый (ОСЧ) 98,5%, «Amresco», США;

борная кислота (ХЧ), «Химмед», Россия;

натрия фосфата 1-замещенный моногидрат, (ОСЧ) 99.9%, «GERBU», Германия;

калий фосфат двузамещенный, безводный (ОСЧ) >99,0%, «Amresco», США;

маркёр молекулярного веса ДНК плазмиды pBR322, обработанная рестриктазой Alul, водный раствор 200 мкг/мл, «СибЭнзим», Россия;

маркёр молекулярного веса ДНК фага X, обработанная рестриктазой Bmel8I, водный раствор 200 мкг/мл, «СибЭнзим», Россия;

маркёр молекулярного веса «100 Ь.р.», водный раствор 200 мкг/мл, «СибЭнзим», Россия.

Соляная кислота, хлороформ, изо амиловый и изопропиловый спирты закуплены в «Химмед», Россия. Маркёры молекулярного веса закуплены в ЗАО «СибЭнзим», Россия. Остальные реактивы закуплены в ЗАО «Хеликон», Россия.

2.2. Расходные материалы

В нашей работе были использованы следующие одноразовые пластиковые расходные материалы:

микроцентрифужные пробирки с градуировкой на 1,5 мл, «QSP», США;

цветные тонкостенные микропробирки на 0,6 мл, «QSP», США;

жёлтые наконечники с фаской, наносимый объем от 1 до 200 мкл,

«HTL», Польша;

наконечники стандартные голубые, наносимый объём от 100 до 1000 мкл, Gilson-совместимого формата, «QSP», США.

Все расходные материалы закуплены в ЗАО «Хеликон», Россия.

2.3. Буферные растворы

Для создания в растворах оптимальных для реакций концентраций ионов и кислотности были использованы следующие буферные растворы:

буфер PBS: 1,7 мМ КНгРСч, 5,2 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCl;

лизирующий буфер: 10 мМ Трис-HCl рН=8,0 при 25 С, 200 мМ EDTANa2, 0,5% SDS;

буфер ТЕ: 10 мМ Трис-HCl рН 8,0 при 25 С, 5 мМ EDTA Naz;

буфер для ПНР: 60 мМ Трис-HCl рН 8,5 при 25 С, 25 мМ КС1, 10 мМ Р-меркаптоэтанол, 0,1% Тритон Х-100, ЗАО «СибЭнзим», Россия;

буфер для рестриктазы Mspl (буфер В): 10 мМ Трис-HCl рН 7,6 при 25 С, 10 мМ MgCh, 1 мМ DTT, ЗАО «СибЭнзим», Россия;

буфер для рестриктазы Bse3DI (буфер G): 10 мМ Трис-HCl рН 7,6 при 25 С, 10 мМ MgCh, 50 мМ NaCl, 1 мМ DTT, ЗАО «СибЭнзим», Россия;

буфер для рестриктазы Bmel8I (буфер О): 10 мМ Трис-HCl рН 7,6 при 25 С, 10 мМ MgCh, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT, ЗАО «СибЭнзим», Россия;

буфер ТВЕ (для электрофореза): 89 мМ Трис-НСІ, 890 мМ борная кислота, 2 мМ EDTA (рН=8.0);

буфер для внесения проб в гель: 0,03% бромфеноловый синий,

0,03% 59

ксиленцианол FF, 60% глицерин, 1% SDS, 100 мМ EDTA Na2.

Буферы для рестриктаз и Taq-полимеразы закуплены в ЗАО «СибЭнзим», остальные буферы приготовлены самостоятельно.

2.4. Дизайн исследования

В проспективное исследование включались больные с диагнозами: постоянная форма фибрилляции предсердий, тромбоз глубоких вен нижних конечностей, наличие протезов клапанов сердца, у которых отсутствуют противопоказания к применению варфарина. Всем больным до начала терапии варфарином проводилось фармакогенетическое тестирование, на основании результатов которого, а также информации о поле, возрасте, весе пациента рассчитывалась начальная доза ЛС. Срок наблюдения — до 1 года, однако анализировались данные пациентов, полученные в течение 6 месяцев. После подбора индивидуальной дозы варфарина измерение MHO выполнялось 1 раз в 3 недели, или по необходимости — при развитии эпизодов гипокоагуляций и/или кровотечений. Целевой диапазон MHO для больных с фибрилляцией предсердий и тромбозом глубоких вен составил 2,0-3,0. Для больных с искусственными клапанами сердца - 2,5-3,5 соответственно, согласно рекомендациям ВНОК. Эпизодами чрезмерной гипокоагуляций считались все случаи превышения терапевтического диапазона. В качестве контроля выступала группа больных (78 человек) с постоянной формой фибрилляции предсердий, тромбозом глубоких вен, протезированными клапанами сердца, получавших варфарин, изученная в ретроспективном исследовании «Влияние генетического полиморфизма CYP2C9 на фармакокинетику и фармакодинамику варфарина у больных с постоянной формой фибрилляции предсердий» [Михеева Ю.А., Сычев ДА.,

2006, 2008]. Сравнительная характеристика групп пациентов представлена в разделе «Результаты и обсуждения».

2.5. Определение показателя MHO

Определение MHO производилось в образцах капиллярной крови на приборе CoaguChekXS («Roche», Швейцария).

2.6. Выделение геномной ДНК

100 мкл венозной крови человека дважды отмывали 500 мкл буфера PBS. После второй отмывки над осадком оставляли 100 мкл супернатанта, ресуспендировали осадок пипетированием, добавляли 150 мкл лизирующего буфера и 10 мкл водного раствора протеиназы К в концентрации 10 мг/мл. Проводили инкубацию полученной смеси в течение 3 часов при 65 С. Затем добавляли 10 мкл 2,5 М водного раствора NaCl и последовательно экстрагировали ДНК равными объемами фенола и дважды — смесью хлороформ-изоамиловый спирт 24:1, также в равном объёме, центрифугируя по 10 мин и отбирая водную фазу в новые пробирки. После экстракции к раствору добавляли равный объем изопропилового спирта, центрифугировали 30 мин, супернатант отбрасывали. К осадку добавляли 80% этиловый спирт, центрифугировали 10 мин, сушили при температуре 65 С до полного испарения этилового спирта, растворяли в 50 мкл буфера ТЕ и прогревали 30 мин при 65 С, перемешивая потряхиванием каждые 10 мин. Препараты ДНК хранили при -20 С. Все этапы центрифугирования проводились при 13400 об./мин на центрифуге для микропробирок MiniSpin («Eppendorf», Германия). Для инкубации микропробирок использовали твердобл очные термостаты «Термит» («ДНК-Технология», Россия) и «Термо-24» и «Термо-48» («Biocom», Россия).

2.7. Подбор праймеров для ПЦР

Праймеры подобраны с помощью компьютерной программы «PrimerSelect 4.05» (DNAStar, Inc). Подбор проводился на матрицах из банка данных NCBI, содержавших полные последовательности генов CYP2C9 и VKORC1, включая все экзоны и интроны, референтные номера NC_000010.10 и NC_000016.9, соответственно. При подборе праймеров использовали условия, выставленные авторами программы «по умолчанию», из праймеров, предложенных программой, отбирались те, которые имели максимальный рейтинг при прочих равных условиях. Последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов представлены в табл. 2.7.1.

Таблица 2.7.1. Последовательности праймеров для амплификации исследованных локусов

2.8. Амплификация ДНК

ПЦР проводили на амплификаторах моделей «Терцик ТП4-ПЦР01» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия, закуплен там же), и «Mastercycler» («Eppendorf AG», Германия, закуплен в ЗАО «Хеликон», Россия). Составы реакционных смесей для ПЦР каждого полиморфизма указаны в табл. 2.8.1, программы для амплификации — в табл. 2.8.2.

Таблица 2.8.1. Состав реакционной смеси для ПЦР каждого полиморфизма (мкл)

— Концентрацию хлорида магния подбирали эмпирически

Таблица 2.8.2 Программы для амплификации каждого полиморфизма, С/сек

Первый сегмент программы состоял из денатурации геномной ДНК. Данный процесс осуществляли при 95 С в течение 3 минут. Затем следовали 35 циклов. Каждый цикл состоял из трех стадий: денатурации, отжига и синтеза. Денатурация проводилась в течение 10 сек при 95 С, стадии отжига и синтеза были индивидуальными для каждой программы (табл. 2.8.2).

2.9. Расщепление продуктов амплификации рестриктазами

Аллели различных полиморфных маркеров генов CYP2C9 и VKORC1 идентифицировали путем обработки продуктов ПЦР соответствующими рестриктазами. Рестриктазы Bse3DI и Bmel8I «разрезали» соответствующие аллели «дикого типа» {359Ile I CYP2C9 и 144Arg I CYP2C9). Рестриктаза Mspl также распознавала аллель «дикого типа» (-1639(3673)G I VKORC1).

2.10. Электрофоретическое разделение ДНК

Фрагменты ДНК после амплификации или рестрикции наносили на полиакриламидный гель. В случае продуктов амплификации использовался 5% гель, а в случае рестрикционных фрагментов - 10%. Напряженность электрического поля 10 В/см. Время, необходимое для полноценного разделения продуктов, рассчитывали, исходя из расстояния, пройденного лидирующими маркерными красителями: бромфеноловым синим и ксиленцианолом, входящих в состав буфера для внесения проб в гель. По окончании электрофореза гели окрашивали раствором бромистого этидия (0.5 мкг/мл) в течение 10 мин. и визуализировали на трансиллюминаторе ТСХ-15 М производства «Vilber Lourmat», Франция, закуплен в ООО «Диа-М», Россия, в ультрафиолетовом свете при длине волны 312 нм.

Электрофорез проводили в вертикальной камере VE-4 (производство «ДНК-Технология», РФ, закуплено в ООО «Диа-М», Россия) с использованием буфера ТВЕ по следующей схеме: к пробам в объеме 4,5

мкл (в случае продуктов амплификации) или 10 мкл (в случае продуктов рестрикции) добавляли 1/5 объема буфера для внесения проб в гель. Полученную смесь наслаивали в лунки геля при помощи специального наконечника с вытянутым кончиком. Размер фрагментов определяли с помощью маркеров молекулярного веса, наносимых в количестве 150 нг на дорожку.

2.11. Статистическая обработка результатов

Анализ результатов выполнен методами непараметрической статистики (критерий х2, точный двусторонний критерий Фишера, критерий Манна-Уитни) с помощью статистических программ Biostat и Instat.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование

Проведенное нами исследование являлось проспективным, и ставило перед собой задачу изучения антикоагулянтного действия и параметров безопасности АКНД варфарина, дозирование которого основывалось на результатах фармакогенетического тестирования, у больных с высоким риском тромбоэмболических осложнений, впервые получавших данный препарат. Для оценки преимуществ индивидуального дозирования варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования было необходимо провести сравнение результатов проспективного исследования с результатами ретроспективного исследования, проводимого ранее в нашей лаборатории, в котором варфарин дозировался по традиционной схеме, а генотипирование пациентов было выполнено, но его результаты не принимались во внимание врачом при дозировании варфарина. При проведении ретроспективного исследования наблюдалась группа пациентов (п=78), получавших впервые назначенный им варфарин в течение года, с последующим анализом количеств кровотечений и эпизодов чрезмерной гипокоагуляции (повышение MHO более 3) и их сопоставлении с результатами генотипирования пациентов по локусам CYP2C9 и VKORCL Результаты проведенной работы, качественный состав группы и показания к применению АКНД позволяют нам брать данную группу и сопоставлять полученные в вышеупомянутой работе результаты с полученными в проспективном исследовании.

В первой группе (Группа А) находятся больные (п=78), которым варфарин назначался по традиционной схеме, начиная с дозы 5 мг/сутки с последующим подбором поддерживающей дозы путем мониторирования MHO. Во вторую группу (группа Б) были включены больные (п=76),

получавшие варфарин по тем же показаниям, но начальная доза препарата рассчитывалась по специальной формуле, включавшей в себя результаты фармакогенетического тестирования (данные о полиморфизме гена CYP2C9 и VKORC1), сопутствующей патологии, физикальных данных и данных о сопутствующей терапии. Так как главное отличие используемого нами метода выбора начальной дозы препарата заключается в использовании результатов предварительного фармакогенетического тестирования, обе сравниваемые группы должны иметь одинаковый генетический «профиль», а так же возрастные, тендерные и прочие характеристики. Только в этом случае выявленные различия можно было бы объяснить именно за счет нового «фармакогенетического» подхода к дозированию варфарина.

Таблица 3.1.1. Возраст пациентов

В таблице 3.1.1 представлен возраст пациентов с постоянной формой фибрилляции предсердий. Из приведенных данных видно, что среднее значение возраста пациентов в группе А, получавшей варфарин обычным способом составляет 63,4 года, тогда как в группе Б средний возраст составляет 60,3 лет. Данное незначительное (критерий Манна-Уитни, р=0,07) различие можно объяснить наличием в группе Б пациента 19 лет с идиопатической постоянной формой мерцательной аритмии.

Таблица 3.1.2. Тендерный состав групп

Таблица 3.1.2 определяет тендерный состав двух сравниваемых групп, очевидно, что обе группы не имеют достоверных различий (точный двусторонний критерий Фишера, р=0,147). То есть возможные различия тендерного состава не смогли бы оказать влияние на результат исследования.

Таблица 3.1.3. Рост пациентов

Рост пациентов, принимавших участие в исследовании, приведен в таблице 3.1.3, из которой следует, что средний рост пациентов в группе А равный 174,4 см и данный показатель не отличается от среднего роста в группе Б, где он составил 172,7 см (критерий Манна-Уитни, р=0,44).

Таблица 3.1.4. Вес пациентов

Средний вес пациентов (таблица 3.1.4), принимавших участие в исследовании составил 88,2 кг в группе А и 80,8 кг в группе Б. Данные незначимые (критерий Манна-Уитни, р=0,055) различия можно объяснить наличием в группе А максимума веса в 165 кг по сравнению с максимумом в группе Б- 138 кг.

Таблица 3.1.5. Индекс массы тела пациентов

В таблице 3.1.5 приведены данные по индексу массы тела пациентов обеих групп. Очевидно, что между группами не наблюдается достоверных различий по данному параметру (критерий Манна-Уитни, р=0,267).

Важным критерием сопоставимости групп является оценка риска кровотечений на фоне лечения АКНД. Для оценки риска кровотечений использовалась достаточно известная и хорошо зарекомендовавшая себя шкала риска кровотечений HEMORR2HAGES. Эта шкала, в отличие от других, так же применима и к генетическим особенностям пациента, в плане генотипа CYP2C9. Учитывая систему баллов в этой шкале (от 0 до >5) каждый пациент в группах получил соответствующее число баллов. Среднее число баллов на пациента в группе А составило 1,22, а в группе Б - 1,34 балла соответственно. Для оценки достоверности различий групп по риску развития кровотечений применялся критерий Манна-Уитни.

Таблица 3.1.6.

Среднее число баллов риска развития кровотечений в исследуемых группах, согласно шкале HEMORR2HAGES

Как следует из таблицы 3.1.6 и рисунка 3.1.1, сравниваемые группы достоверно не различались по риску развития кровотечений на фоне применения варфарина (р=0,357). Это говорит об отсутствии дополнительных факторов риска, которые могли бы повлиять на конечный анализ результата исследования, с точки зрения развившихся кровотечений.

Критерий Манна-Уитни р=0.357

Группа А

Группа Б

Рисунок 3.1.1. Различия в группе А и группе Б по риску развития

кровотечений.

В таблицах 3.1.7, 3.1.8, 3.1.9, а также на рисунках 3.1.2 и 3.1.3 подробно рассмотрен и сопоставлен «генетический профиль» наших групп по локусам CYP2C9 и VKORC1. Причем в случае CYP2C9 рассмотрены как аллельные варианты (таблица 3.1.9), так и генотипы по отдельным полиморфным маркерам, формирующим данные генотипы (таблицы 3.1.7 и 3.1.8).

Таблица 3.1.7.

Генотипы полиморфного маркера Argl44Cys гена CYP2C9 в исследованных

группах

Таблица 3.1.8.

Генотипы полиморфного маркера Ile359Leu гена CYP2C9 в исследованных

группах

Таблица 3.1.9. Генотипы по локусу CYP2C9 в исследованных группах

Сопоставление наблюдаемых различий с помощью критерия %2 показало, что они статистически недостоверны (р=0,178 для CYP2C9 и р=0,166 для VKORCl). Поскольку между изученными группами не наблюдалось достоверных различий ни по негенетическим параметрам, влияющим на дозировку варфарина, ни в распределении генотипов по локусам, продукты которых участвуют в формировании ответа организма на варфарин (CYP2C9 и VKORCl), можно сделать вывод о том, что данные группы полностью сопоставимы.

Рисунок 3.1.3. Генетический состав исследованных групп по локусу VKORC1.

Рисунок 3.1.2. Генетический состав исследованных групп по локусу CYP2C9

3.2. Выбор алгоритма дозирования варфарина, с учетом результатов фармакогенетического тестирования для его последующего использования в проспективном исследовании

Запланированное проспективное исследование определило необходимость предварительного выбора алгоритма дозирования варфарина, основанного на результатах фармакогенетического тестирования. Собственно, это и было одной из задач нашей работы.

Рост концентрации варфарина в плазме крови имеет вид экспоненциальной функции. Статистическая обработка множества таких функций позволяет составлять математическое уравнение, решением которого становится предполагаемая доза, для каждого пациента, такое уравнение может включать сколь угодно много аргументов, содержащих математически - выраженные физикальные данные пациента (рост, вес, площадь поверхности тела и др.), в т.ч. и генетические особенности пациента в виде выявляемых генотипов.

Рисунок 3.2.1. Корреляционная зависимость реально подобранной дозы и рассчитанной методом Gage et al.

Мы проводили сравнение пяти вариантов расчетных формул начальной дозы варфарина, учитывающие генотип CYP2C9, а так же

физикальные данные пациентов. Результатом статистической обработки данных явилось преимущество метода Gage et al. (рисунок 3.2.1).

Рисунок 3.2.2. Корреляционная зависимость реально подобранной дозы и рассчитанной методом Sconce et al.

і :

і г

Рисунок 3.2.3. Корреляционная зависимость реально подобранной дозы и рассчитанной методом Takahashi et al.

В наших расчетах участвовали алгоритмы, определяющие наиболее простой способ расчета суточной дозы варфарина и продемонстрировавшие значимые общие результаты в снижении риска чрезмерной гипокоагуляции. При этом целевое MHO во всех исследованиях было 2,5.

2< 23 22 21 20 19 13 17 IS 15 «

' .<

ж *

. : : ; . : :

Рисунок 3.2.4. Корреляционная зависимость реально подобранной дозы и рассчитанной методом Tham et al.

Исследование Gage et al. включило анализ 1015 пациентов, и этот алгоритм является, по нашему мнению, наиболее успешным из всех встречающихся. Алгоритм в своей последней редакции учитывает 18 различных параметров и представлен на бесплатном интернет сайте (. Этот сайт интегрирован с постоянно пополняющейся базой больных, таким образом, точность дозирования возрастает с каждой новой историей болезни. Несмотря на наличие небольшой разницы коэффициентов корреляции между дозами, рассчитанными с помощью алгоритмов Sconce и Gage, в пользу последнего, говорит следующее:

Формула Gage является динамичной, в будущем авторы предполагают включить в нее большее количество аргументов, что, несомненно, скажется на точности расчетов.

В исследовании Gage et al. участвовало большее количество больных, чем во всех остальных.

Takahashi et al. предлагают фиксированные значения по снижению дозы на определенные величины, в зависимости от генотипа CYP2C9, что, на наш взгляд, является не приемлемым для европейской популяции, где полиморфизм CYP2C9 является наиболее вариабельным, в отличие от монголоидных популяций. Поэтому полученная корреляция оказывается значительно скромнее (рисунок 3.2.3). Кроме того, при расчетах авторы игнорировали данные о генотипе VKORC1 и сопутствующей терапии статинами (флувастатин, симвастатин). Многие исследователи склонны даже считать, что аргумент, учитывающий полиморфизм гена CYP2C9, менее значителен для персонализированного подхода в азиатской популяции, чем полиморфизм гена VKORC1.

Однако поиск оптимального алгоритма дозирования актуален так же и с точки зрения доказанного изменения фармакодинамики и фармакокинетики варфарина у больных с различными генотипами по VCORC1, CYP2C9, а другими индивидуальными характеристиками (возраст, вес, пол). Так в исследованиях Hamberg et al. были показаны различия в значениях клиренса варфарина у пациентов старше 70 лет с приблизительно одинаковыми физикальными данными, но с различными генотипами по CYP2C9. Это исследование так же показало значимость CYP2C9, как основного параметра, обуславливающего разброс среднесуточной дозы варфарина, при этом параметр VKORC1 считается менее значительным для европеоидных популяций.

Регрессионная модель Сыркина и соавт. была опубликована во второй половине 2008 года, поэтому мы сочли целесообразным сравнить результаты расчетов данной регрессионной модели с последней модификацией формулы Gage et. al., учитывая ее динамичность, и используя для сравнения уже подобранные дозы варфарина в группе А (рисунки 3.2.5 и 3.2.6).

I I I

Рисунок 3.2.5. Корреляционная зависимость реально подобранной дозы и рассчитанной методом Сыркина А.Л. и соавт.

Рисунок 3.2.6. Корреляционная зависимость реально подобранной дозы и рассчитанной методом Gage et al. в модификации не ранее 2008 г.

При этом коэффициент корреляции реально подобранной дозы варфарина и рассчитанной алгоритмом Gage et al в модификации не ранее 2008 г. составляет 0,88, а коэффициент детерминации 0,6902, соответственно регрессионная модель Сыркина А.Л. и соавт. показывает взаимосвязь с подобранной дозой на уровне коэффициента корреляции равного 0,50, с коэффициентом детерминации 0,257. Такое различие результатов, говорящих не в пользу алгоритма Сыркина А.Л. и соавт. можно объяснить малым количеством пациентов, принимавших участие в исследовании (170 человек),

а так же отсутствием в модели аргументов, учитывающих вес, рост, пол, сопутствующую патологию и генотип VKORC1.

Для выбора оптимального алгоритма дозирования варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования, мы проанализировали данные 78 пациентов, включенных в проведенное ранее ретроспективное исследование, для которых имелась наиболее полная информация для расчета. Включенные в исследование пациенты принимали варфарин в подобранной дозе от 1 месяца до 1 года. Доза варфарина подбиралась по традиционной схеме, начиная с 5 мг/сутки, и корректировалась в соответствии со значениями MHO. Начальная доза варфарина (5 мг/сутки) назначалась согласно инструкции по медицинскому применению данного ЛС из Государственного реестра (. Целевым уровнем MHO считалось 2,0-3,0. После получения результата в этом диапазоне доза считалась подобранной.

Таблица 3.2.2.

Корреляционные связи реально подобранной дозы варфарина с рассчитанной с помощью формул, предложенных различными авторами

Расчет производился по варианту начала 2008 г.

Итак, по результатам корреляционного анализа наилучшим алгоритмом дозирования варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования, можно считать алгоритм Gage et al., для

которого был получен максимальный коэффициент корреляции между реально подобранными и расчетными дозами варфарина (таблица 3.2.2).

В расчетах, выполненых этим методом был выявлен оптимальный баланс между всем анализируемыми показателями.

3.3. Сопоставление частоты развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции при применении варфарина с помощью фармакогенетического и традиционного подходов

Основным методом контроля безопасности терапии АКНД является мониторинг показателя MHO. Когда значение данного показателя у конкретного больного выходит за верхнюю границу терапевтического диапазона, возникает состояние чрезмерной гипокоагуляции. Это свидетельствует о том, что у пациента либо замедлен метаболизм препарата, либо наблюдается повышенное сродство ЛС к молекуле-мишени. При этом чрезмерная гипокоагуляция сопряжена со значительным риском развития геморрагии. И одной из целей применения фармакогенетического подхода к подбору дозы варфарина является снижение ее частоты.

Проведенная нами работа, выявила значительное снижение эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в группе Б, по сравнению с группой А, принимавшей участие в ретроспективном исследовании. На рисунке 3.3.1 представлена частота эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в группе Б (п=76), где представлены больные с фармакогенетически-обусловленным подходом к дозированию, и группе А (п=78), в которую входили больные, получавшие варфарин с помощью традиционного метода дозирования. В группе А эпизоды гипокоагуляции наблюдались у 56,4% больных. Согласно результатам ретроспективного исследования, из 78 пациентов группы А развитие эпизодов чрезмерной гипокоагуляции наблюдалось у 44 человек (то есть, более чем у половины - 56,4%). При этом частота развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в группе Б составляла 17,1% (13 пациентов из

76) - данные представлены на рисунке 4. Проверка наблюдаемых различий с помощью точного двустороннего критерия Фишера показала их высокую статистическую достоверность (р=4,1хЮ"7). Таким образом, применение фармакогенетического алгоритма при подборе ДВ позволяет в 3,3 раза снизить риск развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции.

Рисунок 3.3.1. Наличие эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в сравниваемых группах

3.4. Сопоставление частоты развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции между группой с использованием фармакогенетического подхода к дозированию варфарина и группой традиционного подхода для пациентов с «функционально-дефектными»

аллелями генов CYP2C9 и VKORC1

При всей ценности полученного положительного результата наши расчеты выявили некоторые недостатки примененного алгоритма. Как было ранее показано в ретроспективном исследовании, развитие эпизодов чрезмерной гипокоагуляции ассоциировано с полиморфизмами генов CYP2C9 и VKORC1, при этом ассоциация полиморфизма гена VKORC1 в общей выборке «замаскирована» полиморфизмом гена CYP2C9 и проявляется только в подгруппе пациентов, не имеющих в генотипе функционально-дефектных аллелей гена CYP2C9. В таблице 3.4.1 приводятся данные по сопоставлению взаимосвязи между развитием эпизодов

чрезмерной гипокоагуляции и наличием в генотипе пациента функционально-дефектных аллельньгх вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 в группе Б (пациенты текущего проспективного исследования). Исходя из того, что применение фармакогенетического подхода учитывает ассоциацию генетического полиморфизма CYP2C9 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции, можно было ожидать, что его применение нивелирует данную ассоциацию. Однако проверка достоверности наблюдаемых различий между подгруппами пациентов с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции и без таковых из группы Б с помощью критерия показала, что различия статистически достоверны (р=0,021) т.е. данная ассоциация сохраняется и при применении варфарина с учетом результатов фармакогенетического тестирования. Это означает, что примененный фармакогенетический алгоритм не в полном объеме исключает влияние генетического полиморфизма CYP2C9 на действие варфарина. Еще более интересный результат мы получили при анализе взаимосвязи генетического полиморфизма VKORC1 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в группе Б (см. таблицу 3.4.2). Во-первых, как и в случае CYP2C9, сохраняется ассоциация полиморфизма VKORC1 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции (критерий у, р=0,024). Во-вторых, эта ассоциация выявляется уже в общей группе (без исключения влияния полиморфизма CYP2C9) - исчезает «маскировка» за счет большего влияния на действие варфарина функционально-дефектных аллелей гена CYP2C9.

Очевидным может являться тот факт, что при подборе дозы авторы формулы Gage использовали линейное выражение, которое математически не может позволить необходимого спектра изменения предполагаемой дозы. Точность используемого нами метода является, в некотором смысле, конечной, несмотря на ее динамичность, которая основана на постоянно растущем числе пациентов, к лечению которых она применяется.

Таблица 3.4.1.

Взаимосвязь эпизодов чрезмерной гипокоагуляции с полиморфизмом гена CYP2C9 у больных в группе Б

Таблица 3.4.2.

Взаимосвязь эпизодов чрезмерной гипокоагуляции с полиморфизмом гена VKORC1 у больных в группе Б

Таким образом, существуют все предпосылки к дальнейшей работе по определению, возможно, новых алгоритмов, которые смогли бы позволить нивелировать взаимосвязь эпизодов чрезмерной гипокоагуляции с полиморфизмами генов CYP2C9 и VKORCL

Мы предположили, что дозирование варфарина с помощью фармакогенетического алгоритма, должно быть особенно значимым для

пациентов, имеющих в генотипе «функционально-дефектные» аллели генов CYP2C9 и VKORC1. Поэтому нами были рассмотрены эпизоды чрезмерной гипокоагуляции только у таких пациентов. Количество подобных пациентов в группе А, с традиционным подходом к дозированию варфарина, составило 61 из 78 при этом на этих 61 пациента приходился 31 эпизод чрезмерной гипокоагуляции. В группе Б число пациентов с «функционально-дефектными» аллелями генов CYP2C9 и VKORC1 составило 55 человек, у которых отмечалось 11 эпизодов чрезмерной гипокоагуляции. Таким образом, наблюдается снижение эпизодов чрезмерной гипокоагуляции у таких пациентов из группы Б в 3,1 раза, по сравнению с группой А (р=0,005). Данные представлены в таблице 3.4.3.

Таблица 3.4.3.

Снижение частоты развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции у пациентов с «функционально-дефектными» аллелями генов CYP2C9 и VKORC1

При этом снижение числа эпизодов чрезмерной гипокоагуляции у всех пациентов, получавших предполагаемую дозу, вне зависимости от их генотипа, составляло 3,3 раза, что является еще одним косвенным доводом в пользу необходимости создания более совершенного алгоритма дозирования варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования.

3.5. Сопоставление частоты развития кровотечений при применении варфарина с помощью фармакогенетического и

традиционного подходов

Другим анализируемым параметром в нашем исследовании является частота развития кровотечений. Следует отметить, что в основной группе исследуемых больных (группе Б), отмечен один летальный исход, с диагнозом «Острое нарушение мозгового кровообращения, разрыв левой средней мозговой артерии», однако параметры проведенного ретроспективного исследования в группе А, куда не вошли больные с летальным исходом, не позволяют использовать этот случай для анализа в нашей работе.

ГрутвА Групп Б

Рисунок 3.5.1. Частота развития кровотечений в группе А и группе Б в процентном соотношении

На рисунке 3.5.1 отражены частоты кровотечений в обеих группах. Видно, что из общего числа пациентов, в группе А (п=78), кровотечения наблюдались у 18% больных. Тогда как в группе Б с общим числом пациентов п=76 частота развития кровотечений была 4%.

Различия в частотах кровотечений в группах А и Б оказались статистически значимыми (р=0,009), что является, по нашему мнению, важным положительным результатом, как с точки зрения безопасности для пациентов, так и с точки зрения снижения стоимости их лечения. Последнее предположение требует проведения тщательного фармакоэкономического анализа для своего уточнения. Таким образом, фармакогенетический подход к дозированию варфарина позволил снизить частоту развития кровотечений в 4,5 раза.

3.6. Сопоставление частот развития кровотечений между группой с использованием фармакогенетического подхода к дозированию

варфарина и группой традиционного подхода для пациентов с «функционально-дефектными» аллелями генов CYP2C9 и VKORC1

Из-за крайне малого числа всех (больших и малых) кровотечений, произошедших в группе Б, состоявшей из больных, к которым применялся фармакогенетический подход к дозированию варфарина, оценить взаимосвязь кровотечений с конкретными полиморфизмами генов CYP2C9 и VKORC1 не представлялось возможным.

Как и в случае развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции, мы рассмотрели преимущества фармакогенетического подхода к дозированию варфарина перед традиционным для эпизодов развития кровотечений для пациентов, имеющих в генотипе «функционально-дефектные» аллели генов CYP2C9 и VKORC1. На рисунке 3.6.1 представлен результат такого сопоставления. При этом у таких больных отмечается снижение кровотечений в 3,9 раза при применении фармакогенетического подхода к дозированию варфарина, по сравнению традиционным (р=0,016).

Получается, что наш так называемый «фармакогенетический» алгоритм позволил добиться более скромных результатов в целевой группе

(т.е. у пациентов с «функционально-дефектными аллелями генов CYP2C9 и VKORC1), хотя ожидалось обратное.

Для объяснения подобного несколько обескураживающего эффекта мы предлагаем три гипотезы:

  1. Использованный алгоритм Gage et al. не учитывает всех ключевых генетических факторов, так или иначе оказывающих влияние на фармакогенетику и фармакодинамику варфарина;

  2. Данный алгоритм не учитывает каких-либо негенетических факторов, которые могут изменять лекарственный ответ организма на АКНД;

  3. Необходимо создание принципиально новой математической модели для расчета индивидуальной дозы варфарина на основании результатов фармакогенетического тестирования, построенной на нелинейных принципах, в отличие от модели Gage et al.

Точный критерий Фишера

р=0,016

«5

35 ЯН Есть

Я н« зо 25 20 15 10 5

Группа А Группа Б

Рисунок 3.6.1. Количество кровотечений у пациентов, имеющих полиморфизм CYP2C9 и VKORC1

Тем не менее, мы не можем отрицать, что алгоритм Gage et al. неплохо работает у больных из Московской популяции, поэтому его можно рекомендовать к применению уже сегодня, невзирая на его отдельные недостатки. По нашему мнению, 4,5 кратное снижение частоты развития кровотечений (до 4%) позволит применять варфарин амбулаторно, при условии достаточной комплаентности пациента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время все более популярным становится такое направление как фармакогенетика - раздел науки, возникший на стыке фармакологии и генетики, изучающий влияние генетических особенностей пациента на формирование индивидуального фармакологического ответа при применении ЛС. Эти генетические особенности представляют собой, в основном, однонуклеотидные полиморфизмы в генах, кодирующих белки, «задействованные» в фармакокинетике (ферменты биотрансформации, транспортеры ЛС) или фармакодинамике ЛС (молекулы-мишени для ЛС: рецепторы, ферменты, ионные каналы и т.д.). Благодаря достижениям молекулярной биологии выявление подобных генетических особенностей с помощью ПЦР, становится все более доступным в т.ч. и в экономическом аспекте. Фармакогенетика является бурно развивающейся наукой, для многих ЛС уже проведены фармакогенетические исследования. Это создает предпосылки к персонализации выбора ЛС и их доз на основе генотипирования пациентов, что и является сутью фармакогенетического тестирования, которое в настоящее время признается одним из основных и наиболее перспективных инструментов т.н. персонализированной медицины. Однако одним из существенных препятствий на пути к внедрению фармакогенетического тестирования в клиническую практику, является отсутствие понятных для врача алгоритмов выбора ЛС и их доз на основе результатов фармакогенетического тестирования. Исключением в этом отношении является фармакогенетическое тестирование для персонализации дозирования АКНД варфарина, проведение которого уже сейчас доступно в России. В настоящее время в литературе описано несколько алгоритмов расчета начальной дозы варфарина на основании результатов фармакогенетического тестирования. Однако было не ясно, какой из этих алгоритмов является оптимальным для российских пациентов с высоким

риском тромбоэмболических осложнений, которым планируется применение варфарина.

Поэтому на первом этапе работы мы проводили выбор оптимального для наших пациентов алгоритма дозирования варфарина, основанного на результатах фармакогенетического тестирования, путем корреляционного анализа доз, рассчитанных по описанным алгоритмам, и реально подобранных доз варфарина. Это было выполнено путем анализа данных, полученных в исследовании на 78 пациентах с высоким риском тромбоэмболических осложнений, принявших участие в ранее проведенном в нашей лаборатории ретроспективном исследовании. По всем пациентам имелась информация о результатах генотипирования по локусам CYP2C9 и VKORC1. С использованием генотипов и других характеристик пациентов, принимавших участие в ретроспективном исследовании, были рассчитаны дозы варфарина, исходя из вышеописанных алгоритмов. Затем теоретически рассчитанные дозы варфарина сопоставлялись с реальными дозами, которые были подобраны по стандартной методике под контролем показателя MHO. Как следует из наших расчетов, наиболее сильная корреляционная связь между рассчитанной и подобранной дозой варфарина наблюдалась при использовании алгоритма Gage et al. Полученный коэффициент корреляции 0,88 является очень высоким для подобных биолого-медицинских моделей, что свидетельствует о высокой релевантности использованного алгоритма. Таким образом, на выбор алгоритма Gage et al. в качестве наиболее оптимального для российских пациентов для его использования для дальнейших проспективных исследований, повлияли следующие факторы:

Для данного алгоритма получен самый высокий коэффициент корреляции расчетной дозой варфарина с подобранной стандартным методом;

В соответствующем исследовании Gage et al., результаты которого легли в основу разработки алгоритма, участвовало

наибольшее количество больных и учитывалось максимальное количество индивидуальных параметров пациентов;

Данное уравнение является динамичным, так как авторы создали on-line калькулятор для расчета дозы варфарина ( по их модели и на основании данных, которые присылают специалисты, воспользовавшиеся их программой, постоянно корректируют коэффициенты в своем уравнении.

Итак, мы показали, что для российских больных оптимальным фармакогенетическим подходом к расчету начальной дозы варфарина является алгоритм Gage et al. Именно этот алгоритм дозирования варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования использовался нами в проспективном исследовании, посвященном сравнению фармакогенетического подхода к дозированию варфарина с традиционным.

На втором этапе работы мы провели непосредственно проспективное исследование, оценивающее преимущества фармакогенетического подхода к дозированию варфарина перед традиционным методом. В проспективное исследование включались больные с диагнозами: постоянная форма фибрилляции предсердий, тромбоз глубоких вен нижних конечностей, наличие протезов клапанов сердца, у которых отсутствовали противопоказания к применению варфарина. Всем больным перед началом терапии варфарином проводилось фармакогенетическое тестирование, на основании результатов которого, а также информации о поле и возрасте пациента рассчитывалась начальная доза ЛС (по алгоритму Gage, с помощью on-line калькулятора, размещенного на сайте . После подбора индивидуальной дозы варфарина измерение MHO выполнялось 1 раз в 3 недели или по необходимости — при развитии эпизодов гипокоагуляций и/или кровотечений. Целевой диапазон MHO для больных с фибрилляцией предсердий и тромбозом глубоких вен составил 2,0-3,0; для больных с

искусственными клапанами сердца — 2,5-3,5, соответственно. Эпизодами чрезмерной гипокоагуляции считались все случаи, когда показатель MHO выходил за пределы терапевтического диапазона. Анализировались данные пациентов, полученные в течение 6 месяцев после начала применения варфарина.

При проведении проспективного исследования были получены интересные результаты по сопоставлению эпизодов чрезмерной гипокоагуляции при применении варфарина с помощью фармакогенетического и традиционного подхода к дозированию. Частота развития эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в группе «фармакогенетического» дозирования варфарина составляла 17,1% (у 13 пациентов из 76) в то время как в группе «традиционного» подхода к дозированию варфарина она была выше более чем в 3 раза и составляла 56,4% (у 44 пациентов из 78). При всей ценности полученного положительного результата наши расчеты выявили некоторые недостатки примененного алгоритма расчета начальной дозы варфарина на основе фармакогенетического тестирования. Как было показано ранее, развитие эпизодов чрезмерной гипокоагуляции ассоциировано с генетическим полиморфизмом CYP2C9 и VKORC1. При этом ассоциация полиморфизма гена VKORC1 в общей выборке «замаскирована» полиморфизмом гена CYP2C9 и проявляется только в подгруппе пациентов, не имеющих в генотипе «функционально-дефектных» аллелей гена CYP2C9. Исходя из того, что применение фармакогенетического подхода учитывает ассоциацию генетического полиморфизма CYP2C9 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции, можно было ожидать, что применение такого подхода нивелирует данную ассоциацию. Однако проверка достоверности наблюдаемых различий между подгруппами пациентов с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции и без таковых показала, что ассоциация сохраняется. Это означает, что алгоритм Gage не в полном объеме исключает влияние генетического полиморфизма CYP2C9 на действие варфарина. Еще

более интересный результат мы получили при анализе взаимосвязи генетического полиморфизма VKORC1 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции в группе «фармакогенетического» подхода к дозированию варфарина: как и в случае CYP2C9, сохраняется ассоциация полиморфизма VKORC1 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции. Мы полагаем, что полученные результаты свидетельствуют о том, что использованный фармакогенетический алгоритм Gage в большей степени учитывает эффект «функционально-дефектных» аллелей гена CYP2C9, по сравнению с геном VKORC1. Таким образом, обнаруженные нами ассоциации создают предпосылки для дальнейшего совершенствования фармакогенетического алгоритма дозирования варфарина у российских пациентов с высоким риском тромбоэмболических осложнений.

Как уже обсуждалось выше, у подхода, разработанного Gage et al. есть серьезное преимущество перед всеми остальными алгоритмами. Создание on-line калькулятора, предлагающего специалистам свободно использовать методику в обмен на информацию о полученных результатах, позволяет вести постоянную коррекцию коэффициентов уравнения расчета начальной дозы варфарина. Теоретически, когда количество пациентов, данные которых будут проанализированы авторами уравнения, превысит несколько тысяч, можно ожидать достижения большей корреляции между расчетными и реальными дозами варфарина. Однако, по нашему мнению, при существующей математической формуле расчета этого не произойдет. В уравнении используется самая простая линейная зависимость - уточнение формулы происходит только за счет изменения коэффициентов. А в живых системах линейные модели практически не встречаются. Кроме того, уточнение коэффициентов путем простого добавления большего количества «усредненных» данных приводит к нарушению «истинной» индивидуализации фармакогенетического подхода к дозированию варфарина. Вероятно, предел точности подобной методологии уже достигнут. Необходимо создание новой математической модели, которая

позволит полностью нивелировать взаимосвязь эпизодов чрезмерной гипокоагуляции с генетическим полиморфизмом CYP2C9 и VKORC1. Это может привести к более значительному повышению безопасности терапии варфарином.

Не менее важными были результаты по сопоставлению кровотечений
при применении варфарина с помощью фармакогенетического и
традиционного подхода к дозированию. В группе «фармакогенетического»
подхода к дозированию варфарина, из 76 пациентов кровотечения
развивались у 3, то есть в 4% случаев. В группе «традиционного» подхода к
дозированию варфарина, из 78 больных развитие кровотечений наблюдалось
у 14, что составило 18%, т.е. в 4,5 раза чаще. Полученный результат имеет
большую практическую ценность, как с точки зрения безопасности для
пациента, так и с точки зрения возможной экономии затрат на коррекцию
кровотечений. Однако последнее положение требует уточнения, для чего
необходимо провести специальный фармакоэкономический анализ. Вместе с
тем, результаты зарубежных исследований, сравнивающих

фармакогенетический подход к дозированию варфарина с традиционным, противоречивы. В части исследований не наблюдалось снижения частоты кровотечений при применении фармакогенетического подхода к дозированию варфарина. Возможно, это было связано с использованием в исследованиях различных алгоритмов расчета начальной дозы варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования, а также различным «этническим» составом групп пациентов, включенных в исследования. Из-за малого количества кровотечений, наблюдавшихся в группе «фармакогенетического» подхода к дозированию варфарина, мы не смогли проверить, сохраняется ли ассоциация полиморфизмов генов CYP2C9 и VKORC1 с развитием кровотечений при дозировании варфарина на основе результатов фармакогенетического тестирования.

Следует отметить, что наше исследование имело ряд ограничений:

Мы не проводили рандомизации больных в группах: в качестве группы контроля выступали пациенты из ранее проведенного ретроспективного исследования. Подобная рандомизация технически возможна только в условиях крупного мультицентрового исследования. Наше исследование отчасти можно расценивать как пилотный проект. В тоже время, обе наши группы были однородны по генетическим и негенетическим «детерминантам» чувствительности к варфарину. Поэтому можно предположить, что снижение частоты кровотечений, полученное в исследовании, было связано именно с применением фармакогенетического подхода к дозированию варфарина.

Мы не в полном объеме сопоставляли особенности подбора дозы (длительность подбора дозы). Это было связано с тем, что доза варфарина больным подбиралась в амбулаторных условиях и ее длительность зависела не от медицинских причин, а от возможности пациента посещать врача для измерения MHO и получения рекомендаций.

Таким образом, в нашей работе был использован фармакогенетический подход к дозированию варфарина, который заключался в назначении варфарина в начальной дозе, рассчитанной по алгоритму Gage et al. (on-line калькулятор, . При этом эпизоды чрезмерной гипокоагуляции и кровотечения развивались достоверно реже при применении фармакогенетического подхода к дозированию варфарина, чем при дозировании данного ЛС традиционным методом. Это первое российское исследование, оценивающее преимущества фармакогенетического подхода к дозированию варфарина перед традиционным. Для подтверждения полученных результатов необходимо

проведение более крупного мультицентрового рандомизированного
исследования, по результатам которого можно будет рекомендовать широкое
внедрение фармакогенетического тестирования для персонализации терапии
варфарином. Также мы обнаружили, что применение фармакогенетического
подхода к дозированию варфарина не устраняет ассоциацию полиморфизмов
генов CYP2C9 и VKORC1 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции,
что обуславливает необходимость в совершенствовании

фармакогенетического алгоритма Gage et al. Тем не менее, мы полагаем, что данный алгоритм уже может применяться в клинической практике, особенно у больных с высоким риском кровотечений при терапии АКНД.

выводы

Для российских больных оптимальным

фармакогенетическим подходом к расчету начальной дозы варфарина является алгоритм Gage et al.: для нее обнаружена наиболее сильная по сравнению с другими алгоритмами корреляционная связь между расчетными и реально подобранными дозами варфарина (г=0,887, р<0,0001).

Эпизоды чрезмерной гипокоагуляции развивались реже при применении фармакогенетического подхода к дозированию варфарина по сравнению со стандартным методом дозирования варфарина: 17,1% vs 56,4% (р=4,1><10-7), соответственно.

Кровотечения развивались реже при применении фармакогенетического подхода к дозированию варфарина по сравнению со стандартным методом дозирования варфарина: 4% vs 18% (р=0,009), соответственно.

При применении фармакогенетического подхода к дозированию варфарина сохраняется ассоциация полиморфизмов генов CYP2C9, VKORC1 с развитием эпизодов чрезмерной гипокоагуляции, что создает предпосылки к совершенствованию фармакогенетического алгоритма Gage et al.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для повышения безопасности и достижения стабильного терапевтического эффекта при терапии варфарином необходимо проводить фармакогенетическое тестирование noCYP2C9HVKORCl.

Рассчитывать начальную дозу варфарина у российских пациентов следует по алгоритму Gage et al. (on-line калькулятор, .

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Баркаган З.С., Буевич Е.И., Тимошенко Е.А. Тромбофилия, характеризующаяся резистентностью к антикоагулянтам непрямого действия. // Тер. Архив.— 1995.— Т. 67.— №7. — С. 57-52.

Баркаган З.С. МомотА.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза // Ньюдиамед. — 2001.

Дземешкевич С.Л, Панченко Е.П. Антикоагулянтная терапия у пациентов с клапанными пороками сердца. // РМЖ. — 2001. — Т. 9. — №10.

Козлова Т.В. Контроль за лечением оральными антикоагулянтами. // Фарматека. — 2007. — Т. 3. — №66.

Колчанов Н.А. Регуляция транскрипции генов эукариот: базы данных и компьютерный анализ. // Молекулярная биология. — 1997. — Т. 31. — С. 581-583.

Кукес В.Г. Клиническая фармакология. М.: Гэотар-медиа, 2004.

Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. М.: Реафарм. — 2004. — 144. с.

Кукес В.Г., Сычёв Д.А., Игнатьев И.В. Клиническая фармакогенетика и практическое здравоохранение: перспективы интеграции. Клинико-фармакологические подходы в оптимизации фармакотерапии. М.: 2006.

Левин Б.Р. Теория случайных процессов и ее применение. М.: Госэнергоиздат. — 1959.

  1. Леопольд А. Бернсайт Анализ финансовой отчетности. Финансы и статистика, 2001.

  2. Макацерия А.Д., БецадзеВ.О. Тромбофилии и противотромботическая терапия в акушерской практике. М.: Триада-х, 2003.

  3. Матвеев В.Н., Матюшкин-Герке А.А. Курс математики, ч. 1. М.: Наука.

  4. Панченко Е.П., Кропачева Е.С. Профилактика тромбоэмболии у больных мерцательной аритмией. М.: МИА, 2007. — 144 с.

  5. РатнерВ.А. Концепция молекулярно-генетических систем управления. Новосибирск: НГУ, 1993. — 117 с.

  6. РатнерВ.А., Жарких А.А., Колчанов Н.А. Проблемы теории молекулярной эволюции. М.: Наука., 1985. — 263 с.

  7. Рейхман У.Дж. Применение статистики. 1969.

  8. Середенин СБ. Лекции по фармакогенетике. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. — 303 с.

  9. Сироткина О.В., УлитинаА.С, Тараскина А.Е. Аллельные варианты CYP2C9*2 и CYP2C9*3 гена цитохрома CYP2C9 в популяции Санкт-Петербурга и их клиническое значение при антикоагулянтной терапии варфарином. // Российский кардиологический журнал. — 2004. — Т. 6. — С. 24-31.

  10. Сычев Д.А., Игнатьев И.В., Раменская Г.В., Кукес В.Г. Клиническая фармакогенетика. М.: Гэотар-медиа, 2007.

Чазов Е.И., Беленков Ю.Н. Рациональная фармакотерапия сердечно-сосудистых заболеваний. Литтерра, 2006.

Aithal G.P., Day СР., Kesteven P.J., Daly А.К. Association of polymorphisms in the cytochrome P450 CYP2C9 with warfarin dose requirement and risk of bleeding complications. // Lancet—1999.—Vol.353. —N. 9154. —P. 717-719.

AllabiA.C, GalaJ.L., Horsmans Y. CYP2C9, CYP2C19, ABCBl (MDRl) genetic polymorphisms and phenytoin metabolism in a Black Beninese population. // Pharmacogenetics and genomics. — 2005. — Vol. 15.—N. 11. —P. 779-786.

Aquilante C.L., Langaee T.Y., Lopez L.M. et al. Influence of coagulation factor, vitamin К epoxide reductase complex subunit 1, and cytochrome P450 2C9 gene polymorphisms on warfarin dose requirements. // Clin Pharmacol. Ther. — 2006. — Vol. 79. — N. 4. — P. 291-302.

Benusiglio P.R., Desmeules J., de Moerloose P., Dayer P. Oral anticoagulation and pharmacogenetics: importance in the clinical setting. // Rev. Med. Suisse.— 2007.— Vol. 3.— N. 124.— P. 2030, 2033-2034, 2036.

Bialy D., Lehmann M.N., Schumacher D.N. Hospitalization for arrhythmias in the United States: importance of atrial fibrillation. //J. Am. Coll. Cardiol. — 1992. — Vol. 19. — P. 41.

Blaisdell J., Jorge-Nebert L.F., Coulter S. et al. Discovery of new potentially defective alleles of human CYP2C9. II Pharmacogenetics. — 2004. — Vol. 14. — N. 8. —P. 527-537.

Bodin L., Horellou M.H., Flaujac C, Loriot M.A., Samama M.M. A vitamin К epoxide reductase complex subunit-

1 (VKORCl) mutation in a patient with vitamin К antagonist resistance. // J. Thromb. Haemost.— 2005.— Vol.3.— N.7. —P. 1533-1535.

  1. BorgianiP., Ciccacci C, Forte V., Romano S., Federici G., Novelli G. Allelic variants in the CYP2C9 and VKORCl loci and interindividual variability in the anticoagulant dose effect of warfarin in Italians. // Pharmacogenomics. — 2007. — Vol. 8. — N. 11. —P. 1545-1550.

  2. Brenner S.S., Herrlinger C, DilgerK., MurdterTJE., Hofmann U., Marx C, et al. Influence of age and cytochrome P450 2C9 genotype on the steady-state disposition of diclofenac and celecoxib. // Clin. Pharmacokinet.— 2003.— Vol.42.— P. 283-292.

  3. Brockmoller J., TzvetkovM.V. Pharmacogenetics: data, concepts and tools to improve drug discovery and drug treatment. // European journal of clinical pharmacology. — 2008. — Vol. 64. —N. 2. —P. 133-157.

  4. CainD., Hutson S.M., WallinR. Assembly of the warfarin-sensitive vitamin К 2,3-epoxide reductase enzyme complex in the endoplasmic reticulum membrane. // J. Biol. Chem. — 1997. — Vol. 272. — N. 46. — P. 29068-29075.

  5. Carlquist J.F., McKinney J.T., Nicholas Z.P. et al. Rapid melting curve analysis for genetic variants that underlie interindividual variability in stable warfarin dosing. // J. Thromb. Thrombolysis. — 2008. — Vol. 26. — N. 1. — P. 1-7.

  6. Caldwell M.D., BergR.L., Zhang K.Q. etal. Evaluation of genetic factors for warfarin dose prediction. // Clinical medicine & research. — 2007. —Vol. 5. — N. 1. —P. 8-16.

  7. Chen K., Wang R., Wen S.Y., Li J., Wang S.Q. Relationship of P450 2C9 genetic polymorphisms in Chinese and the pharmacokinetics of tolbutamide. // Journal of clinical pharmacy and therapeutics. — 2005. — Vol. 30. —N. 3. — P. 241-249.

  8. ChoHJ., SohnK.H., ParkH.M. etal. Factors affecting the interindividual variability of warfarin dose requirement in adult Korean patients. // Pharmacogenomics. — 2007. — Vol. 8. — N.4. —P. 329-337.

  9. Copland M., Walker I.D., Campbell R. Oral Anticoagulation and Hemorrhagic Complications in an Elderly Population With Atrial Fibrillation. // Arch Intern Med.- 2001.- Vol. 161.-N. 17.-P. 2125-2128.

  10. Crawford D.C., Ritchie M.D., RiederM.J. Identifying the genotype behind the phenotype: a role model found in VKORC1 and its association with warfarin dosing. // Pharmacogenomics. — 2007. — Vol. 8. — N. 5. — P. 487-496.

  11. Daly A.K., Aithal G.P. Genetic regulation of warfarin metabolism and response. // Semin. Vase. Med.— 2003.— Vol. 3. — N. 3. — P. 231-238.

  12. D'AndreaG., D'Ambrosio R.L., DiPernaP., ChettaM., Santacroce R., Brancaccio V. A polymorphism in the VKORC1 gene is associated with an interindividual variability in the dose-anticoagulant effect of warfarin. // Blood. — 2005. — Vol. 105. —P. 645-649.

Dijk K.N., Plat A.W., van Dijk A.A. et al. Potential interaction between acenocoumarol and diclofenac, naproxen and ibuprofen and role of CYP2C9 genotype. // Thromb. Haemost. — 2004. — Vol. 91.—N. 1.—P. 95-101.

Emery R.W., Emery A.M., Raikar G.V., Shake J.G. Anticoagulation for mechanical heart valves: a role for patient based therapy. // J. Thromb. Thrombolysis. — 2008. — Vol.25.—N. 1.—P. 18-25.

Fihn S.D., McDommel M., Matin D. etal. Risk factors for complications of chronic anticoagulation. A multicenter study. Warfarin Optimized Outpatient Follow-up Study Group. // Ann Intern. Med. — 1993. — Vol. 118. —N. 7. — P. 511-520.

Gaedigk A., Casley W.L., Tyndale R.F., Sellers E.M., Jurima-RometM., LeederJ.S. Cytochrome P4502C9 (CYP2C9) allele frequencies in Canadian Native Indian and Inuit populations. // Can. J. Physiol. Pharmacol.— 2001.— Vol.79.— N. 10.— P. 841-847.

Gage B.F. et al. Clinical classification schemes for predicting hemorrhage: Results from the National Registry of Atrial Fibrillation (NRAF). // Am. Heart J. — 2006.

Gage B.F., Eby C.S. Pharmacogenetics and anticoagulant therapy. // J. Thromb. Thrombolysis. — 2003.

Gage B.F., Lesko LJ. Pharmacogenetics of warfarin: regulatory, scientific, and clinical issues. // J. Thromb. Thrombolysis. — 2008. — Vol. 25. — N. 1. — P. 45-51.

GeisenC, WatzkaM., SittingerK. etal. VKORC1 haplotypes and their impact on the inter-individual and inter-ethnical

variability of oral anticoagulation. // Thromb. Haemost.— 2005. — Vol. 94. — N. 4. — P. 773-779.

  1. Gellekink H., den Heijer M., Kluijtmans L.A., Blom HJ. Effect of genetic variation in the human S-adenosylhomocysteine hydrolase gene on total homocysteine concentrations and risk of recurrent venous thrombosis.//PMID: 15241484.

  2. GoodstadtL., PontingC.P. Vitamin К epoxide reductase: homology, active site and catalytic mechanism. // Trends Biochem. Sci. — 2004. — Vol. 29. — N. 6. — P. 289-292.

  3. Gorter J.W. for the Stroke Prevention In Reversible Ischemia Trial (SPIRIT) and European Atrial Fibrillation Trial (EAFT) study groups. Major bleeding during anticoagulation after cerebral ischemia: patterns and risk factors. // Neurology.— 1999.

  4. Harrington DJ., Underwood S., Morse C, Shearer M.J., Tuddenham E.G., Mumford A.D. Pharmacodynamic resistance to warfarin associated with a Val66Met substitution in vitamin К epoxide reductase complex subunit 1. // Thromb. Haemost.— 2005.—Vol.93.—N. 1.—P. 23-26.

  5. Herman D., Locatelli I., Grabnar I. et al. Influence of CYP2C9 polymorphisms, demographic factors and concomitant drug therapy on warfarin metabolism and maintenance dose. // The pharmacogenomics journal.— 2005.— Vol.5.— N. 3.— P. 193-202.

  6. Herman D., PeternelP., StegnarM., BreskvarK., Dolzan V. The influence of sequence variations in factor VII, gamma-glutamyl carboxylase and vitamin К epoxide reductase complex

genes on warfarin dose requirement. // Thromb Haemost.—

2006. — Vol. 95. — N. 5. — P. 782-787.

  1. Higashi M.K., Veenstra D.L., Kondo L.M., Wittkowsky A.K., Srinouanprachanh S.L., Farin F.M., Rettie A.E. Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy. // JAMA. — 2002. — Vol.287.—N. 13. —P. 1690-1698.

  1. HillmanMA., WilkeR.A., Yale S.H., Vidaillet H.J., Caldwell M.D., GlurichL, BergRX., SchmelzerJ., Burmester J.K. A prospective, randomized pilot trial of model-based warfarin dose initiation using CYP2C9 genotype and clinical data. // Clin. Med. Res. — 2005. — Vol. 3. — N. 3. — P. 137-145.

  2. Imai J., IeiriL, MamiyaK. etal. Polymorphism of the cytochrome P450 (CYP) 2C9 gene in Japanese epileptic patients: genetic analysis of the CYP2C9 locus. // Pharmacogenetics. — 2000. — Vol. 10. — N. 1. — P. 85-89.

  3. Itoh S., Onishi S. Developmental changes of vitamin К epoxidase and reductase activities involved in the vitamin К cycle in human liver. // Early Hum. Dev. — 2000. — Vol. 57. — N. 1. —P. 15-23.

  4. Jiang N.X., Song J., XuB. Vitamin К epoxide reductase complex 1 gene polymorphism and warfarin dose requirement in Chinese patients. // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi.—

2007. — Vol. 35. — N. 7. — P. 652-654.

  1. Kamali F. Genetic influences on the response to warfarin. // Curr. Opin. Hematol. — 2006. — Vol. 13. — N. 5. — P. 357-361.

  2. KastorJ.A. Arrhythmias. Philadelphia: W.B. Saunders company. — 1994. — P. 25-124.

  3. Kerr J.S., LiH.Y., WexlerR.S. etal. The characterization of potent novel warfarin analogs. // Thromb. Res.— 1997.— Vol. 88. — N. 2. —P. 127-136.

  4. Kessler P. Pharmacogenetics of warfarin. // Vnitrni lekarstvi. — 2006. — Vol. 52. — P. 31-34.

  5. KiddR.S.5 Curry T.B., Gallagher S., EdekiT., BlaisdellJ., Goldstein J.A. Identification of a null allele of CYP2C9 in an African-American exhibiting toxicity to phenytoin. // Pharmacogenetics. — 2001. — Vol. 11.—N. 9. — P. 803-808.

  6. Kimura R., Miyashita K., Kokubo Y. et al. Genotypes of vitamin К epoxide reductase, gamma-glutamyl carboxylase, and cytochrome P450 2C9 as determinants of daily warfarin dose in Japanese patients. // Thromb. Res. — 2007. — Vol. 120. — N.2. —P. 181-186.

  7. Kirchheiner J., Bauer S., Meineke I. et al. Impact of CYP2C9 and CYP2C19 polymorphisms on tolbutamide kinetics and the insulin and glucose response in healthy volunteers. // Pharmacogenetics. — 2002. — Vol. 12.—N. 2. —P. 101-109.

  8. Kirchheiner J., Brockmoller J. Clinical consequences of cytochrome P450 2C9 polymorphisms. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2005. — Vol. 77. — N. 1. — P. 1-16.

  9. Kirchheiner J., Brockmoller J., Meineke I. et al. Impact of CYP2C9 amino acid polymorphisms on glyburide kinetics and on the insulin and glucose response in healthy volunteers. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2002. — Vol. 71. — N. 4. — P. 286-296.

  10. Kirchheiner J., Meineke I., Freytag G., Meisel C, Roots I., Brockmoller J. Enantiospecific effects of cytochrome P450 2C9 amino acid variants on ibuprofen pharmacokinetics and on the inhibition of cyclooxygenases 1 and 2. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2002. — Vol. 72. — N. 1. — P. 62-75.

  11. Kirchheiner J., Meineke I., MullerG. et al. Influence of CYP2C9 and CYP2D6 polymorphisms on the pharmacokinetics of nateglinide in genotyped healthy volunteers. .// Clinical pharmacokinetics. — 2004. — Vol. 43. —N. 4. — P. 267-278.

  12. Kirchheiner J., Meineke I., Steinbach N., Meisel C, Roots I., Brockmoller J. Pharmacokinetics of diclofenac and inhibition of cyclooxygenases 1 and 2: no relationship to the CYP2C9 genetic polymorphism in humans. // British journal of clinical pharmacology. —2003.—Vol. 55. —N. 1.—P. 51-61.

  13. Kirchheiner J., StormerE., Meisel C, Steinbach N., Roots I., Brockmoller J. Influence of CYP2C9 genetic polymorphisms on pharmacokinetics of celecoxib and its metabolites. // Pharmacogenetics. —2003. —Vol. 13.—N. 8. —P. 473^180.

  14. Kohnke H., Sorlin K., Granath G., Wadelius M. Warfarin dose related to apolipoprotein E (APOE) genotype. // Eur. J. Clin. Pharmacol. — 2005.

  15. Krynetskiy E., McDonnell P. Building individualized medicine: prevention of adverse reactions to warfarin therapy. //

J.Pharmacol. Exp. Ther.— 2007.— Vol.322.— N. 2.— P. 427-^34.

LalS., JadaS.R., XiangX., LimW.T., LeeEJ., ChowbayB. Pharmacogenetics of target genes across the warfarin pharmacological pathway. // Clinical, pharmacokinetics.— 2006. — Vol. 45. — N. 12. — P. 1189-1200.

Lee S.C., Ng S.S., Oldenburg J. et al. Interethnic variability of warfarin maintenance requirement is explained by VKORC1 genotype in an Asian population. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2006. —Vol.79.—N.3. —P. 197-205.

Li Т., Lange L.A., Li X. et al. Polymorphisms in the VKORC1 gene are strongly associated with warfarin dosage requirements in patients receiving anticoagulation. // J. Med. Genet. — 2006. — Vol. 43. — N. 9. — P. 740-744.

LiptonP. Pharmacogenetics: the ethical issues. // Pharmacogenomics J. — 2003. — Vol. 3. —P. 14-16.

LoebsteinR., DvoskinL, HalkinH. etal. A coding VKORC1 Asp36Tyr polymorphism predisposes to warfarin resistance. // Blood. — 2007. — Vol. 109. — N. 6. — P. 2477-2480.

Loebstein R., Vecsler M., Kurnik D. et al. Common genetic variants of microsomal epoxide hydrolase affect warfarin dose requirements beyond the effect of cytochrome P450 2C9. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2005. — Vol. 77. —N. 5. — P. 365-372.

Loriot M.A., Beaune P. Vitamin К epoxide reductase: Fresh blood for oral anticoagulant therapies. // Rev. Med. Interne. — 2006. —Vol.27.—N. 12. —P. 979-982.

  1. Loriot M.A., BeauneP. Pharmacogenetics of oral anticoagulants: individualized drug treatment for more efficacy and safety. // Rev. Prat. — 2007. — Vol. 57. — N. 12. — P. 1281-1286.

  2. Mann M.W., Pons G. Various pharmacogenetic aspects of antiepileptic drug therapy: a review. // CNS drugs. — 2007. — Vol. 21. — N. 2. —P. 143-164.

  3. Marsh S., McLeod H.L. Pharmacogenomics: from bedside to clinical practice. // Hum. Мої. Genet. — 2006. — Vol. 15 Spec N. 1. —P.R89-93.

  4. Martin J.H., Begg E.J., Kennedy M.A., Roberts R., Barclay M.L. Is cytochrome P450 2C9 genotype associated with NSAID gastric ulceration? // British journal of clinical pharmacology. — 2001. —Vol. 51. —N. 6. — P. 627-630.

  5. Hillman M.A., Wilke R.A., Caldwell M.D., Berg R.L., Glurich I., Burmester J.K. Relative impact of covariates in prescribing warfarin according to CYP2C9 genotype. // Pharmacogenetics. -2004. - Vol. 14. - N. 8. - P. 539-47.

  6. MichaudV., VanierM.C, Brouillette D. et al. Combination of phenotype assessments and CYP2C9-VKORC1 polymorphisms in the determination of warfarin dose requirements in heavily medicated patients. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2008. — Vol. 83. — N. 5. — P. 740-748.

  7. Millican E.A., Lenzini P.A., Milligan P.E. et al. Genetic-based dosing in orthopedic patients beginning warfarin therapy. // Blood. —2007. —Vol. 110.—N. 5. —P. 1511-1515.

  8. MomaryK.M., Shapiro NX., VianaM.A., NutescuE.A., Helgason СМ., Cavallari L.H. Factors influencing warfarin dose requirements in African-Americans. // Pharmacogenomics. — 2007.—Vol. 8.—N. 11. —P. 1535-1544.

  9. MoridaniM., FuL., SelbyR., Francisco Y., Tatjana S. Frequency of CYP2C9 polymorphisms affecting warfarin metabolism in a large anticoagulant clinic cohort. // Clinical Biochemistry. — 2006. — Vol. 39. — P. 606-612.

  10. Ndegwa S. Pharmacogenomics and warfarin therapy. // Issues Emerg Health Technol. — 2007. — N. 104. —P. 1-8.

  11. Nussbaum R.L., Mclnnes R.R., WillardH.F. Thompson & Thompson Genetics in Medicine. 7th ed. Nussbaum, Mclnnes, Willard: Saunders / Elsevier. — 2007.

  12. Oldenburg J., Bevans C.G., Fregin A., Geisen C, Muller-Reible C, Watzka M. Current pharmacogenetic developments in oral anticoagulation therapy: the influence of variant VKORC1 and CYP2C9 alleles. // Thromb Haemost. — 2007.— Vol. 98. — N. 3. —P. 570-578.

  13. Oldenburg J., Bevans C.G., Muller C.R., Watzka M. Vitamin К epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1): the key protein of the vitamin К cycle. // Antioxid Redox Signal. — 2006. — Vol. 8. — N. 3-4. — P. 347-353.

  14. Oldenburg J., von BrederlowB., Fregin A. etal. Congenital deficiency of vitamin К dependent coagulation factors in two families presents as a genetic defect of the vitamin K-epoxide-reductase-complex. // Thromb Haemost. — 2000. — Vol. 84. — N. 6. —P. 937-941.

  15. Oldenburg J., WatzkaM., Rost S., MullerC.R. VKORCl: molecular target of coumarins. // J. Thromb Haemost. — 2007. —Vol. 5 Suppl 1. —P. 1-6.

  16. Osman A., Enstrom C, Arbring K., Soderkvist P., Lindahl T.L. Main haplotypes and mutational analysis of vitamin К epoxide reductase (VKORCl) in a Swedish population: a retrospective analysis of case records. // J. Thromb. Haemost. — 2006. — Vol.4.—N. 8. —P. 1723-1729.

  17. Osman A., Enstrom C, Lindahl T.L. Plasma S/R ratio of warfarin co-varies with VKORCl haplotype. // Blood Coagul Fibrinolysis. —2007. — Vol. 18. —N. 3. — P. 293-296.

  18. PelzHJ., Rost S., HuenerbergM. The genetic basis of resistance to anticoagulants in rodents. // Genetics. - Published Articles Ahead of Print: May 6. - 2005.

  19. PeyvandiF., SpreaficoM., Siboni S.M., MoiaM., Mannucci P.M. CYP2C9 genotypes and dose requirements during the induction phase of oral anticoagulant therapy. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2004. — Vol. 75. —N. 3. — P. 198-203.

  20. Reitsma P.H., van der Heijden J.F., Groot A.P., Rosendaal F.R., BullerH.R. A C1173T dimorphism in the VKORCl gene determines coumarin sensitivity and bleeding risk. // PLoS Med. — 2005. — Vol. 2. —N. 10. — P. 312.

  21. RettieA.E., FarinF.M., BeriN.G., Srinouanprachanh S.L., RiederMJ., ThijssenH.H. A case study of acenocoumarol sensitivity and genotype-phenotype discordancy explained by combinations of polymorphisms in VKORCl and CYP2C9. II

British journal of clinical pharmacology. — 2006. — Vol. 62. — N. 5. —P. 617-620.

Rettie A.E., Tai G. The pharmocogenomics of warfarin: closing in on personalized medicine. // Мої. Interv.— 2006.— Vol. 6. — N. 4. — P. 223-227.

Rieder M.J., Reiner A.P., GageB.F. etal. Effect of VKORC1 haplotypes on transcriptional regulation and warfarin dose. // N. Engl. J. Med. — 2005. — Vol. 352. — N. 22. — P. 2285-2293.

Rieder M.J., Reiner A.P., Rettie A.E. Gamma-glutamyl carboxylase (GGCX) tagSNPs have limited utility for predicting warfarin maintenance dose. // J. Thromb. Haemost. — 2007. — Vol. 5. — N. 11. — P. 2227-2234.

Rost S., Fregin A., Hunerberg M., Bevans C.G., Muller C.R., Oldenburg J. Site-directed mutagenesis of coumarin-type anticoagulant-sensitive VKORC1: evidence that highly conserved amino acids define structural requirements for enzymatic activity and inhibition by warfarin. // Thromb. Haemost. — 2005. — Vol. 94. — N. 4. — P. 780-786.

Rost S., Fregin A., Ivaskevicius V. et al. Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2. // Nature.— 2004.— Vol.427.— N. 6974. —P. 537-541.

SandbergM., Johansson I., Christensen M., RaneA., EliassonE. The impact of CYP2C9 genetics and oral contraceptives on cytochrome P450 2C9 phenotype. // Drug

metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. — 2004. — Vol. 32. —N. 5. — P. 484-489.

Sanderson S., Emery J., Phil D. CYP2C9 gene variants, drug dose, and bleeding risk in warfarin-treated patients // A HuGEnet systematic review and meta-analysis. // Genet Med. - 2005. - Vol. 7. -N. 2. - P. 97-104.

Schalekamp Т., Brasse B.P., Roijers J.F. et al. VKORC1 and CYP2C9 genotypes and acenocoumarol anticoagulation status: interaction between both genotypes affects overanticoagulation. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2006. — Vol. 80. — N. 1. — P. 13-22.

Sconce E.A., Avery P J., Wynne H.A., Kamali F. Vitamin К epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1) polymorphism influences the anticoagulation response subsequent to vitamin К intake: a pilot study. // J. Thromb. Haemost. — 2008. — Vol. 6. — N. 7. — P. 1226-1228.

Sconce E.A., DalyA.K., Khan T.I., Wynne H.A., Kamali F. APOE genotype makes a small contribution to warfarin dose requirements. // Pharmacogenetics and genomics. — 2006. — Vol. 16.—N. 8.—P. 609-611.

Sconce E.A., Kamali F. Appraisal of current vitamin К dosing algorithms for the reversal of over-anticoagulation with warfarin: the need for a more tailored dosing regimen. // Eur. J. Haematol. — 2006. — Vol. 77. — N. 6. — P. 457-462.

Sconce E.A., Khan T.I., Wynne H.A. et al. The impact of CYP2C9 and VKORC1 genetic polymorphism and patient characteristics upon warfarin dose requirements: proposal for a

new dosing regimen. // Blood. — 2005. — Vol. 106. — N. 7. — P. 2329-2333.

  1. Scordo M.G., AklilluE., YasarU., DahlM.L., Spina E., Ingelman-Sundberg M. Genetic polymorphism of cytochrome P450 2C9 in a Caucasian and a black African population. // British journal of clinical pharmacology. — 2001. — Vol. 52. — N.4. —P. 447-450.

  2. Scordo M.G., CaputiA.P., D'Arrigo C, FavaG., Spina E. Allele and genotype frequencies of CYP2C9, CYP2C19 and CYP2D6 in an Italian population. // Pharmacol. Res. — 2004. — Vol. 50. — N. 2. —P. 195-200.

  3. Shon J.H., Yoon Y.R., Kim K.A., Lim Y.C., Lee K.J., Park J.Y. Effects of CYP2C19 and CYP2C9 genetic polymorphisms on the disposition of and blood glucose lowering response to tolbutamide in humans. // Pharmacogenetics. — 2002. — Vol. 12. —P. 111-119.

  4. SiguretV. Impact of pharmacogenetics on interindividual variability in the response to vitamin К antagonist therapy. // Pathol. Biol. (Paris) . — 2007. — Vol. 55. — N. 6. — P. 295-298.

  5. Stafford D.W. The vitamin К cycle. // J. Thromb. Haemost. — 2005. —Vol. 3.—N. 8. —P. 1873-1878.

  6. Sullivan P.W., ArantT.W., Ellis S.L., UlrichH. The cost effectiveness of anticoagulation management services for patients with atrial fibrillation and at high risk of stroke in the US. // Pharmacoeconomics.— 2006.— Vol.24.— N. 10.— P.1021-1033.

\

  1. Sullivan-Klose Т.Н., GhanayemB.L, BellD.A. etal. The role of the CYP2C9-Lqu359 allelic variant in the tolbutamide polymorphism. // Pharmacogenetics.— 1996.—. Vol.6.— N.4. — P. 341-349.

  2. SychovD.A., KropachevaE.S., Ignat'evI.V. etal. Pharmacogenetics of indirect anticoagulants: value of genotype for improvement of efficacy and safety of therapy. // Kardiologiia. — 2006. — Vol. 46. — N. 7. — P. 72-77.

  3. TakahashiH., Wilkinson G.R., NutescuE.A., MoritaT., Ritchie M.D., ScordoM.G. Different contributions of polymorphisms in VKORC1 and CYP2C9 to intra- and inter-population differences in maintenance dose of warfarin in Japanese, Caucasians and African-Americans. // Pharmacogenet. Genomics. —2006. —Vol. 16.—N. 101. —P. Q10.

  4. Taube J., Halsall D., Baglin T. Influence of cytochrome P-450 CYP2C9 polymorphisms on warfarin sensitivity and risk of over-anticoagulation in patients on long-term treatment. // Blood. — 2000. —Vol. 96.—N. 1816. —P. Q9.

  5. Thijssen H.H., Drittij-Reijnders M.J. Vitamin К metabolism and vitamin Kl status in human liver samples: a search for inter-individual differences in warfarin sensitivity. // Br. J. Haematol. — 1993. — Vol. 84. — N. 4. —P. 681-685.

  6. Thompson C.A. Ximelagatran data fail to impress FDA. // Am. J. Health Syst. Pharm.— 2004.— Vol.61.— N.23.— P. 2472, 2474-2475, 2480.

  7. Tie J.K., Nicchitta C, von Heijne G., Stafford D.W. Membrane topology mapping of vitamin К epoxide reductase by in vitro

translation / cotranslocation. // J. Biol. Chem. — 2005. — Vol.280.—N. 16. —P. 16410-16416.

  1. Veenstra D.L., You J.H., Rieder MJ. et al. Association of Vitamin К epoxide reductase complex 1 (VKORCl) variants with warfarin dose in a Hong Kong Chinese patient population. // Pharmacogenetics and genomics.— 2005.— Vol.15.— N. 10. — P. 687-691.

  2. VerstuyftC, Robert A., Morin S. et al. Genetic and environmental risk factors for oral anticoagulant overdose. // European journal of clinical pharmacology.— 2003.— Vol. 58.—N. 11. —P. 739-745.

  3. Visser L.E., van Schaik R.H., van Vliet M. et al. Allelic variants of cytochrome P450 2C9 modify the interaction between nonsteroidal anti-inflammatory drugs and coumarin anticoagulants. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2005. — Vol. 77. — N. 6. — P. 479^185.

  4. Wadelius M., ChenL.Y., Downes K., Ghori J., Hunt S., Eriksson N. Common VKORCl and GGCX polymorphisms associated with warfarin dose. // Pharmacogenomics J. — 2005. — Vol. 5. — P. 262-270.

  5. Wadelius M.5 ChenL.Y., Eriksson N. etal. Association of warfarin dose with genes involved in its action and metabolism. //Hum. Genet —2007.—Vol. 121.—N. 1.—P. 23-34.

  6. Wadelius M., PirmohamedM. Pharmacogenetics of warfarin: current status and future challenges. // The pharmacogenomics journal. — 2007. — Vol. 7. — N. 2. — P. 99-111.

  1. Wadelius M., Sorlin К., Wallerman О., Karlsson J., Yue Q.Y., Magnusson P.K. Warfarin sensitivity related to CYP2C9, CYP3A5, ABCB1 (MDR1) and other factors. // Pharmacogenomics J. - 2004. - Vol. 4. - N. 1. - P. 40-8.

  2. Wen M.S., LeeM., Chen J.J. etal. Prospective study of warfarin dosage requirements based on CYP2C9 and VKORC1 genotypes. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2008. — Vol. 84. — N. 1.—P. 83-89.

  3. WolfP.A., DawberT.R., Thomas H.E., KannelW.B. Epidemiologic assessment of chronic atrial fibrillation and risk of stroke: the Framingham study. // Neurology.— 1978.— Vol. 28.—N. 10. —P. 973-977.

  4. Yin Т., MiyataT. Warfarin dose and the pharmacogenomics of CYP2C9 and VKORC1 — rationale and perspectives. // Thromb. Res. — 2007. — Vol. 120.—N. 1. —P. 1-Ю.

  5. YouJ.H., TsuiK.K., WongR.S., Cheng G. Potential clinical and economic outcomes of CYP2C9 and VKORC1 genotype-guided dosing in patients starting warfarin therapy. // Clin. Pharmacol. Ther. — 2009. — Vol. 86. — N. 5. — P. 540-547.

  6. Yuan H.Y., Chen J.J., Lee M.T. et al. A novel functional VKORC1 promoter polymorphism is associated with inter-individual and inter-ethnic differences in warfarin sensitivity. // Hum. Мої. Genet.— 2005.— Vol. 14.— N. 13.— P. 1745-1751.


© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net