Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Медицинские науки
Клиническая фармакология

Диссертационная работа:

Павлова Светлана Ивановна. Иммуносупрессивные и противоопухолевые фармакодинамические эффекты флавоноидов корней солодки: автореферат дис. ... кандидата медицинских наук: 14.03.06 / Павлова Светлана Ивановна;[Место защиты: ГОУ ВПО РГМУ им. Н.И. Пирогова].- Москва, 2012.- 48 с.

смотреть введение
Введение к работе:

Актуальность проблемы

За последние десятилетия в медицине произошел переход исследований на молекулярный уровень, и появились более детальные сведения о патогенезе многих заболеваний, существенно изменившие представления о фармакотерапевтических подходах к их лечению [Козлов И.Г., 2006]. Важнейшим достижением этого этапа исследований стало выявление молекул, которые играют ведущую роль в возникновении или прогрессировании патологического процесса. Это сформировало концепцию мишень-направленной терапии и обосновало актуальность разработки инновационных «таргетных» препаратов, способных селективно корригировать ключевые звенья патогенеза.

В связи с завершением интенсивных исследований в биотехнологии и иммунологии, а также молекулярной биологии и генетике рака, во второй половине XX века были разработаны и внедрены принципиально новые иммуносупрессанты и противоопухолевые препараты. Примерами таковых лекарственных средств являются моноклональных антитела и низкомолекулярные ингибиторы сигнальных молекул (циклоспорин, макролидные антибиотики, «тинибы») [Кренски А. с соавт., 2006]. Механизмы действия таких лекарственных средств основаны не на неспецифическом уничтожении активно пролиферирующих клеток, а целенаправленной элиминации/угнетении опухолевых или иммунокомпетентных клеток идентичной природы.

Перспективы развития данных областей фармакотерапии тесно связаны с открытием более специфичных мишеней. Так, несомненно, актуальным является изыскание высоко избирательных иммуносупрессантов, не оказывающих влияния на клетки, которые не участвуют в иммунном ответе в момент терапевтического использования препаратов. Мишенью для этой подгруппы может являться запущенный в активированных лимфоцитах конкретный регуляторный или эффекторный механизм [Козлов И.Г., 2006]. Идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и клонов лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. На место подобных иммуносупрессантов на сегодняшний день претендуют так называемые «регуляторы/переключатели» иммунного ответа.

Безусловно, «таргетные» лекарственные средства кардинально изменили стратегию фармакотерапии, продемонстрировав высочайшую эффективность в отношении отдельных заболеваний (например, некоторых онкогематологических). Однако довольно часто эффект такого препарата оказывается ниже ожидаемого, а резистентность к нему развивается так же, как и при стандартной терапии. Таким образом, в большинстве случаев современные средства служат лишь дополнением к стандартным схемам лечения, в которых классические «нетаргетные» противоопухолевые и иммуносупрессивные препараты все еще занимают лидирующее положение.

С точки зрения разработки новых лекарственных препаратов, большой интерес представляет класс полифенольных соединений растительного происхождения, поскольку многие флавоноиды демонстрируют разнообразные биологические эффекты на организменном уровне [Donfack J.H. et al., 2010; . et al., 2009; Lu J. et al., 2011; . et al., 2011]. Изучение их механизмов действия на клеточном и молекулярном уровнях показывает, что некоторые флавоноиды способны селективно влиять на активность протеинкиназ [Atluru D. et al., 1991; Akiyama T. et al., 1987; Trevillyan J.M. et al., 1990], а, как следствие, и на активацию сигнальных путей в клетках млекопитающих [. et al., 2004; Funakoshi-Tago M. et al., 2008; Hirao K. et al., 2010]. На наш взгляд, на этом механизме действия может базироваться не только противоопухолевый, но и селективный иммуносупрессивный эффекты флавоноидов. Это требует экспериментального обоснования возможности применения полифенольных соединений в клинической иммунологии и онкологии. В связи с чем представляется актуальным исследования иммунотропной и противоопухолевой эффективности веществ флавоноидной структуры, а также прицельное изучение селективности их влияния на различные звенья (адаптивное и врожденное) иммунной системы.

Цель и задачи

Цель: экспериментальное обоснование перспективы создания новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств на основе соединений флавоноидной структуры, выделенных из экстракта корней солодки.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

  1. Отработать технологию выделения и стандартизации биологически активной фракции флавоноидов корней солодки (ФКС).

  2. Оценить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) и функциональную активность (продукция цитокинов) клеток адаптивного иммунитета в моделях активации T- и B-лимфоцитов in vitro.

  3. Исследовать фармакологическую эффективность ФКС в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности (контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ); реакции трансплантат против хозяина; овальбумин-индуцированной бронхиальной астме).

  4. Изучить молекулярные и клеточные механизмы иммунотропных эффектов ФКС, используя модель ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности у мышей.

  5. Оценить влияние ФКС на некоторые функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета in vitro: экспрессию поверхностных маркеров активации, продукцию активных форм кислорода, а также поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов.

  6. Провести оценку влияния ФКС на некоторые показатели врожденного иммунитета in vivo в экспериментальных моделях пептон-индуцированной миграции фагоцитов в брюшную полость и острой стафилококковой инфекции у мышей.

  7. Изучить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) клеток различных опухолевых линий и оценить прямую цитотоксичность флавоноидов солодки по отношению к опухолевым клеткам in vitro.

  8. Провести оценку эффективности ФКС в моно- и комбинированной с циклофосфамидом экспериментальной терапии в модели перевиваемого лимфолейкоза P388 у мышей.

  9. Наметить пути выделения фармакологически активных соединений суммарной фракции ФКС.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. ФКС подавляют пролиферацию активированных T- и B-лимфоцитов in vitro. Возможными механизмами отмены активации лимфоцитов являются как прямое антипролиферативное действие, так и изменение баланса T-хелперных цитокинов, но не индукция апоптоза.

  2. ФКС проявляют иммуносупрессивные эффекты в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности у мышей: ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной бронхиальной астмы.

  3. Механизмами иммуносупрессорного действия ФКС in vivo являются: ингибирование пролиферации лимфоцитов; изменение цитокинового баланса, свидетельствующее о «переключении» дифференцировки субпопуляций T-лимфоцитов-хелперов при индукции иммунного ответа; а также непрямая отрицательная регуляция функций зрелых T-лимфоцитов-эффекторов.

  4. ФКС практически полностью отменяя активацию клеток адаптивного иммунного ответа, незначимо изменяют функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета: экспрессию активационных маркеров, миграционную, поглотительную и микробицидную функцию фагоцитов.

  5. ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в культуре опухолевых клеток различного гистогенеза, а также повышают эффективность циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии.

Научная новизна исследования

В работе был отработан и модифицирован метод выделения фармакологически активных полифенольных соединений из экстракта корней солодки. Для повышения репрезентативности исследований многокомпонентного препарата каждую новую серию выделенных флавоноидов в дополнение к общеизвестному фотохимическому методу (цветная реакция с галловой кислотой) предложено стандартизовать в биологической системе (по выраженности угнетения пролиферации опухолевой линии).

Используя стандартизированный препарат флавоноиднов корней солодки, впервые было проведено исследование его фармакодинамических эффектов в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с иммунотропной и противоопухолевой активностью.

Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных Т- и B-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза. Одним из механизмов антипролиферативного эффекта является модулирующее влияние ФКС на продукцию цитокинов: подавление секреции ИЛ-2 и ИФН, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.

Впервые было показано, что ФКС при парентеральном введении проявляют фармакологическую эффективность в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности у мышей: подавляют характерные проявления ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной бронхиальной астмы.

Впервые было продемонстрировано, что внутривенное введение ФКС на ранних сроках после ДНФБ-сенсибилизации приводит как подавлению пролиферативного ответа, так и к снижению абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов. Это коррелирует с изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФН и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности флавоноидов солодки переключать Th1/Th2 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование Th17-лимфоцитов.

Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенсибилизации, обработка флавоноидами солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации T-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам. Впервые установлено, что блокирующий эффект ФКС не наблюдается в случае обработки CD8+ лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки CD4+-популяции (не проявляют свойств эффекторов контактной чувствительности) и последующего ее адоптивного переноса совместно с CD8+-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.

Впервые показано, что внутривенное введение флавоноидов солодки мышам с овальбумин-индуцированной бронхиальной астмой на стадиях сенсибилизации снижает уровень сывороточных антиген-специфических IgE и IgG1, а также изменяет спектр синтезируемых спленоцитами цитокинов (уменьшение секреции ИЛ-2, и увеличение продукции ИФН и ИЛ-17). Это может свидетельствовать о способности ФКС переключать Th2 иммунный ответ в процессе сенсибилизации к овальбумину на формирование антагонистичных популяций Th1/Th17-лимфоцитов.

Кроме того, продемонстрировано, что введение препарата ФКС на стадии провокации бронхиальной астмы интрафарингеальным введением овальбумина мышам, приводит к значимому уменьшению воспалительной инфильтрации бронхов и уменьшению эозинофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости.

Комплексная оценка влияния ФКС на функции фагоцитов показала, что при использовании их в концентрации (20 мкг/мл), практически отменяющей пролиферацию активированных T- и B-лимфоцитов, не происходит подавления активации, а также миграционной, поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов и моноцитов/макрофагов. Наряду с этим внутрибрюшинное введение ФКС повышает резистентность мышей к острой стафилококковой инфекции. Это позволяет говорить о возможности селективного иммуносупрессивного эффекта ФКС: ингибировании адаптивного звена иммунной системы, без выраженного подавления функций клеток-эффекторов врожденного иммунитета.

С использованием различных опухолевых клеточных культур продемонстрировано, что ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в опухолевых клетках различного видового и гистологического происхождения, а также повышают эффективность алкилирующего цитостатика циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии перевиваемого лимфолейкоза P388 у мышей.

На основании сравнительного химического и фармакологического анализа в ходе разделения суммарного препарата ФКС определена наиболее активная фракция флавоноидов солодки.

Практическая значимость работы

В процессе работы был отработан и модифицирован метод, позволяющий без значительных трудовых затрат, получать биологически активные полифенольные соединения из экстракта корней солодки, а также подобран комплекс моделей и методов, позволяющих оценивать иммунотропную и противоопухолевую активность и эффективность новых фармакологических агентов.

Совокупность полученных в работе данных углубляет фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа и патогенезе иммунопатологических процессов, а также дополняют сведения о механизмах фармакологического действия биологически активных веществ флавоноидной структуры.

Доказанное в ходе выполнения работы отсутствие прямой цитотоксичности, возможность регуляции иммунного ответа, а также различное влияние препарата ФКС на функции иммунокомпетентных клеток, участвующих в механизмах врожденного и адаптивного звеньев иммунитета открывает возможность селективной фармакологической иммуносупрессии.

Выявленные в исследованиях принципиально новые механизмы иммунотропного и противоопухолевого действия ФКС, низкомолекулярная структура флавоноидов (что определяет возможность их химического синтеза и направленной модификации), а также данные, полученные в ходе анализа отдельных фракций, являются достаточным основанием для рассмотрения флавоноидов корней солодки как перспективной основы для разработки новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ. Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ, отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздравсоцразвития РФ.

Публикации и апробация работы

Материалы диссертации были представлены на III Съезде фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008); Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008); Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (Казань, 2009); 2nd European Congress of Immunology «Immunity for Life, Immunology for Health» (Берлин, Германия, 2009); III World Asthma and COPD Forum and the World Forum of Pediatrics (Дубаи, ОАЭ, 2010); IV World Asthma and COPD Forum, XVI International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immunorehabilitation (Париж, Франция, 2011); 30th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (Стамбул, Турция, 2011); 11th Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies (Вашингтон, США, 2011); III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Достижения молекулярной медицины как основа разработки инновационных лекарственных средств» (Волгоград, 2011).

Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МБФ и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работы, в том числе статей в изданиях рекомендованных ВАК РФ – 22.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста в виде монографии и состоит из введения, главы, посвященной материалам и методам исследований, а также 6 глав, каждая из которых включает обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение. В конце диссертации представлены заключение, выводы и библиографический указатель, включающий 314 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 56 рисунками и содержит 16 таблиц.


© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net